參苓白術(shù)散對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠Th17/Treg免疫平衡的影響※

齊云菲,牛明了,張龍江

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450002；2.河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）屬于炎癥性疾病中的一種,又稱(chēng)為非特異性潰瘍性結(jié)腸炎。UC病變以結(jié)腸黏膜層潰瘍?yōu)橹?可累及整個(gè)結(jié)腸,病變主要為結(jié)腸與直腸黏膜及下層彌漫性、連續(xù)性、非特異性炎癥[1]。近年來(lái),隨著人們生活習(xí)慣與飲食結(jié)構(gòu)的改變,全球UC發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)[2]。UC病程漫長(zhǎng),常遷延難愈,甚至可發(fā)生癌變,嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[3]。目前,UC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,臨床治療以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、水楊酸類(lèi)藥物及抗生素為主,雖可緩解相關(guān)癥狀,但長(zhǎng)期使用存在嚴(yán)重的不良反應(yīng),患者依存性差,且停藥后易復(fù)發(fā)。中醫(yī)治療疾病重視辨證論治,標(biāo)本兼治,不僅療效良好,且不良反應(yīng)少。參苓白術(shù)散常用于治療脾胃氣虛、濕阻氣滯證,是臨床治療UC的常用方劑,療效確切[4]。實(shí)驗(yàn)研究表明,參苓白術(shù)散可改善UC模型大鼠的癥狀、體征,調(diào)節(jié)血清炎癥因子表達(dá),減輕UC腸黏膜損傷[5]。本研究通過(guò)建立UC大鼠模型,觀察參苓白術(shù)散對(duì)UC大鼠血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、Th17和Treg細(xì)胞水平及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響,以探討參苓白術(shù)散改善UC的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 選擇SPF級(jí)SD大鼠60只,體質(zhì)量160～180 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)合格證:SYXK（豫）2018-0014。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào):DWLL2018030032）。

1.2 藥品與試劑 中藥由河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供,參苓白術(shù)散處方:麩炒白術(shù)、山藥、茯苓、白參各15 g,白扁豆12 g,蓮子肉、麩炒薏苡仁各10 g,炙甘草9 g,砂仁（后下）、桔梗各6 g。美沙拉嗪（牡丹江恒遠(yuǎn)藥業(yè)股份有限公司）,水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）,5%三硝基苯磺酸（TNBS,Sigma公司）,IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）,IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司）,RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑（ECL）Prime蛋白印跡試劑（賽默飛世爾科技有限公司）,RORγt抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）,β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、HRP-羊抗大鼠二抗、FoxP3抗體（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）。

1.3 儀器 TGL-16C型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）,全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）,CytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）,AE160型精密天平秤（Mettler公司）,蛋白印跡電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 將參苓白術(shù)散先浸泡30 min,再加水煎煮2次,合并2次藥液,并濃縮至含生藥2.26 g/m L。

2.2 分組與造模 將60只SPF級(jí)SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、模型組、參苓白術(shù)散低劑量組、參苓白術(shù)散中劑量組、參苓白術(shù)散高劑量組和沙美拉嗪組,每組10只。除空白組外,其余5組大鼠均采用TNBS-乙醇灌腸法造模。大鼠造模前禁食不禁水24 h,以300 mg/kg水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉,然后用2 mm的硅膠管插入大鼠肛門(mén)約5 cm處,緩慢注入5%TNBS＋50%乙醇,劑量為0.02 m L/kg,灌注結(jié)束后,輕柔大鼠腹部并提起尾巴,使其頭部朝下10 min,待其清醒后正常喂養(yǎng),若動(dòng)物出現(xiàn)黏液膿血便、腹瀉,則造模成功?？瞻捉M大鼠除5%TNBS替換為0.9%氯化鈉注射液外,其余操作與造模大鼠相同。

2.3 給藥 根據(jù)動(dòng)物體表系數(shù)換算法得出大鼠參苓白術(shù)散用量為22.6 g/kg。參苓白術(shù)散低、中、高劑量組分別給予11.3、22.6、45.2 g/kg參苓白術(shù)散水煎液灌胃,美沙拉嗪組給予0.4 g/kg美沙拉嗪灌胃,空白組與模型組分別給予與美沙拉嗪組等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃,連續(xù)給藥14 d。

2.4 取材 大鼠給藥14 d后禁食12 h,用300 mg/kg水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血,離心、收集血清,置于－80℃冰箱凍存。另取結(jié)腸組織,用0.9%氯化鈉注射液沖洗后置于－80℃冰箱凍存。

2.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo) ①疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）:主要觀察大鼠體質(zhì)量、糞便性狀及直腸出血情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):體質(zhì)量下降率＜1%計(jì)0分,下降率1%～5%計(jì)1分,下降率6%～10%計(jì)2分,下降率＞10%計(jì)3分；糞便顆粒與硬度適中計(jì)0分,糞便顆粒成形、較軟、不黏附肛門(mén)計(jì)1分,糞便顆粒柔軟且黏附肛門(mén)計(jì)2分,糞便不成形、黏附肛門(mén)、腹瀉計(jì)3分；糞便無(wú)異常計(jì)0分,糞便有暗紅色斑點(diǎn)計(jì)1分,糞便有暗紅色斑點(diǎn)、肛門(mén)可見(jiàn)出血計(jì)3分,糞便深紅色、肛門(mén)周?chē)醒吼じ接?jì)3分。DAI評(píng)分＝（體質(zhì)量下降率評(píng)分＋糞便評(píng)分＋大便潛血評(píng)分）/3,于給藥第7、14日進(jìn)行評(píng)定。②血清IL-6、IL-10水平:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定。③大鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞水平及Th17/Treg值:給藥14 d后取大鼠尾靜脈血,用機(jī)械法獲取單個(gè)核細(xì)胞懸液,加入細(xì)胞分離液,2 000 r/min離心20 min,去掉中間單個(gè)核細(xì)胞,計(jì)數(shù)并稀釋到所需濃度,分別加入相應(yīng)抗體,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。④結(jié)腸組織RORγt、FoxP3表達(dá):提取結(jié)腸組織總蛋白,分裝,－20℃保存,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD值計(jì)算直線回歸方程,求出樣品蛋白濃度。制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂奶粉的緩沖液室溫?fù)u床封閉2 h,加入一抗（RORγt或FoxP3抗體）,4℃孵育過(guò)夜,清洗后加入二抗（HRP-羊抗大鼠抗體）,37℃搖床孵育2 h,清洗多余二抗,ECL顯色,用BandScan軟件分析膠片灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,多組間數(shù)據(jù)使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DAI評(píng)分比較 藥7 d后,參苓白術(shù)散中、高劑量組及美沙拉嗪組DAI評(píng)分均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散高劑量組與美沙拉嗪組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。給藥14 d后,參苓白術(shù)散各組及美沙拉嗪組DAI評(píng)分均低于模型組（P＜0.05）,且參苓白術(shù)散高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 6組大鼠不同治療時(shí)間疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分比較(分,±s)

表1 6組大鼠不同治療時(shí)間疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分比較(分,±s)

注:與模型組同期比較,▲P＜0.05；與參苓白術(shù)散高劑量組同期比較,*P＜0.05。

組別 只數(shù) 給藥7 d后評(píng)分 給藥14 d后評(píng)分空白組 10 － －模型組 10 2.32±0.13 2.46±0.18參苓白術(shù)散低劑量組 10 2.14±0.20 1.98±0.15▲參苓白術(shù)散中劑量組 10 2.00±0.10▲ 1.72±0.12▲參苓白術(shù)散高劑量組 10 1.86±0.17▲ 1.54±0.18▲美沙拉嗪組 10 1.72±0.12▲ 1.12±0.12▲*

3.2 血清IL-6、IL-10水平比較 給藥14 d后,模型組血清IL-6水平高于空白組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散各組及美沙拉嗪組均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散中、高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）；模型組IL-10水平低于空白組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散中、高劑量組及美沙拉嗪組均高于模型組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散中、高劑量組與美沙拉嗪組比較無(wú)顯著差異（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 6組大鼠給藥14 d后血清白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-10水平比較(ng/g,±s)

表2 6組大鼠給藥14 d后血清白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-10水平比較(ng/g,±s)

注:與空白組比較,△P＜0.05；與模型組比較,▲P＜0.05；與參苓白術(shù)散高劑量組比較,*P＜0.05。

組別 只數(shù) 白細(xì)胞介素-6 白細(xì)胞介素-10空白組 10 46.23±7.01 12.95±1.30模型組 10 260.31±7.01△ 7.75±0.16△參苓白術(shù)散低劑量組 10 195.04±5.17▲ 8.58±0.81參苓白術(shù)散中劑量組 10 144.80±7.44▲ 9.70±0.34▲參苓白術(shù)散高劑量組 10 113.13±5.33▲ 10.96±0.57▲美沙拉嗪組 10 88.06±2.36▲*12.03±0.74▲

3.3 外周血Th17、Treg細(xì)胞水平及Th17/Treg值比較 給藥14 d后,模型組外周血Th17細(xì)胞水平及Th17/Treg值均高于空白組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散各組及美沙拉嗪組均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散中、高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）；模型組Treg細(xì)胞水平低于空白組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散各組及美沙拉嗪組高于模型組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 6組大鼠給藥14 d后外周血Th17、Treg細(xì)胞水平及Th17/Treg值比較(±s)

表3 6組大鼠給藥14 d后外周血Th17、Treg細(xì)胞水平及Th17/Treg值比較(±s)

注:與空白組比較,△P＜0.05；與模型組比較,▲P＜0.05；與參苓白術(shù)散高劑量組比較,*P＜0.05。

組別 只數(shù) Th17（%） Treg（%） Th17/Treg值空白組 10 1.67±0.14 2.98±0.09 0.56±0.06模型組 10 6.17±0.36△ 0.85±0.18△ 7.54±1.63△參苓白術(shù)散低劑量組 10 4.20±0.04▲ 1.46±0.14▲ 2.90±0.25▲參苓白術(shù)散中劑量組 10 3.30±0.18▲ 2.05±0.19▲ 1.63±0.22▲參苓白術(shù)散高劑量組 10 2.67±0.12▲ 2.19±0.12▲ 1.22±0.04▲美沙拉嗪組 10 2.11±0.17▲*2.51±0.11▲*0.85±0.08▲*

3.4 結(jié)腸組織RORγt、Fox P3表達(dá)水平比較 給藥14 d后,模型組結(jié)腸組織RORγt表達(dá)水平高于空白組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散中、高劑量組和美沙拉嗪組均低于模型組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散高劑量組高于美沙拉嗪組（P＜0.05）；模型組結(jié)腸組織FoxP3表達(dá)水平低于空白組（P＜0.05）,參苓白術(shù)散各組和美沙拉嗪組高于模型組（P＜0.05）,但組間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖1（圖1見(jiàn)標(biāo)題處二維碼）。

表4 6組大鼠給藥14 d后結(jié)腸組織RORγt、FoxP3蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表4 6組大鼠給藥14 d后結(jié)腸組織RORγt、FoxP3蛋白表達(dá)水平比較(±s)

注:與空白組比較,△P＜0.05；與模型組比較,▲P＜0.05；與參苓白術(shù)散高劑量組比較,*P＜0.05。

組別 只數(shù) RORγt FoxP3空白組 10 0.056 6±0.003 5 0.676 4±0.048 4模型組 10 0.183 8±0.003 0△ 0.176 8±0.012 3△參苓白術(shù)散低劑量組 10 0.161 8±0.005 2 0.430 6±0.019 8▲參苓白術(shù)散中劑量組 10 0.132 0±0.003 9▲ 0.561 6±0.032 3▲參苓白術(shù)散高劑量組 10 0.106 6±0.004 0▲ 0.594 4±0.059 3▲美沙拉嗪組 10 0.080 0±0.005 7▲*0.637 4±0.047 1▲

4 討論

研究顯示,UC的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,通常認(rèn)為與遺傳、飲食、免疫等因素有關(guān),其中免疫反應(yīng)失調(diào)是UC發(fā)病的重要因素,過(guò)度的免疫活動(dòng)是UC發(fā)病的最終環(huán)節(jié)。當(dāng)腸道出現(xiàn)過(guò)度的免疫活動(dòng)時(shí),促炎細(xì)胞因子與抑炎細(xì)胞因子表達(dá)失衡,巨噬細(xì)胞釋放IL-6、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）等促炎細(xì)胞因子損傷消化道,破壞腸黏膜屏障,產(chǎn)生免疫損傷效應(yīng),導(dǎo)致UC發(fā)生[6]。西醫(yī)治療UC的藥物包括水楊酸制劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇、免疫抑制劑、生物制劑等,雖起效快,但無(wú)法根治,激素依賴(lài)及抵抗、不良反應(yīng)、耐藥性等難題亟待解決[7]。

UC歸屬于中醫(yī)“痢疾”“腸癖”“久痢”等范疇,多因脾肺氣虛導(dǎo)致氣機(jī)不暢、瘀血內(nèi)生而致。脾虛則運(yùn)化失司,機(jī)體津液代謝障礙,形成痰濕,痰濕與瘀血互結(jié),困于腸道,使腸絡(luò)瘀阻,出現(xiàn)血敗肉腐、腸腑潰結(jié)之證。該病屬本虛標(biāo)實(shí)之證,本虛為脾肺氣虛,標(biāo)實(shí)為濕熱瘀毒蘊(yùn)結(jié)腸道[8]。參苓白術(shù)散是臨床治療脾虛濕盛證的代表方劑之一,出自《太平惠民和劑局方》,具有益氣健脾、祛濕止瀉功效,契合UC病機(jī)[9]。本研究結(jié)果顯示,參苓白術(shù)散干預(yù)后,中、高劑量組DAI評(píng)分顯著降低,提示適宜劑量的參苓白術(shù)散可有效減輕UC模型大鼠的病變程度。

Th17介導(dǎo)炎性反應(yīng),Treg介導(dǎo)免疫耐受與自穩(wěn),兩者功能相反,處于動(dòng)態(tài)平衡,二者失衡則導(dǎo)致機(jī)體免疫力和抗炎能力下降,引發(fā)各種炎癥性疾病[10]。研究發(fā)現(xiàn),Th17/Treg失衡參與了腸道疾病的發(fā)生與發(fā)展,在炎癥性腸病中,Th17/Treg值與病情程度密切相關(guān)[11]。Th17可通過(guò)介導(dǎo)炎性反應(yīng),促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子分泌,如IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等,導(dǎo)致組織炎性浸潤(rùn)和組織破壞,出現(xiàn)腸黏膜損傷[12]。而Treg可分泌IL-10等抗炎細(xì)胞因子,具有抑制炎性反應(yīng)等作用[13]。研究顯示,RORγt是Th17分化的重要轉(zhuǎn)錄因子,而FoxP3是公認(rèn)的CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞特異性標(biāo)志因子[14]。當(dāng)IL-6等細(xì)胞因子功能亢進(jìn)時(shí),RORγt表達(dá)升高,而Fox P3表達(dá)降低,造成 Th17/Treg向Th17傾斜,使促炎作用增強(qiáng)[15]。李姿慧等[16]研究發(fā)現(xiàn),參苓白術(shù)散可降低UC模型大鼠血清IL-6水平,控制大鼠的炎性反應(yīng),減少結(jié)腸黏膜充血、水腫及潰瘍形成,改善腸黏膜損傷。本研究結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組大鼠血清IL-6水平、結(jié)腸組織RORγt表達(dá)及外周血Th17/Treg值顯著升高,血清IL-10水平、FoxP3表達(dá)水平顯著降低。參苓白術(shù)散干預(yù)后,大鼠血清IL-6水平、結(jié)腸組織RORγt表達(dá)水平及外周血Th17/Treg值明顯下調(diào),血清IL-10水平、結(jié)腸組織FoxP3表達(dá)水平明顯上調(diào),提示參苓白術(shù)散可能通過(guò)調(diào)節(jié)RORγt、FoxP3表達(dá),進(jìn)而糾正UC大鼠Th17/Treg失衡現(xiàn)象,緩解炎性反應(yīng),達(dá)到治療UC的目的。

中醫(yī)運(yùn)用辨證論治,注重整體觀念,對(duì)UC的治療具有療效確切、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì),但仍存在問(wèn)題,如參苓白術(shù)散為復(fù)方,成分復(fù)雜,其確切的抗UC成分及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。