紫河車(chē)飲片干浸膏粉及配方顆粒的位點(diǎn)特異性PCR鑒別△

趙玉洋，秦雯，李源森芋，袁媛*，金艷，張輝，蔣超*

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.北京城市學(xué)院，北京 100083；3.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，深圳 518029

紫河車(chē)（Placenta Hominis）為健康人的干燥胎盤(pán)，具有溫腎補(bǔ)精、益氣養(yǎng)血之功效[1]。生血丸、安坤贊育丸、補(bǔ)腎固齒丸、河車(chē)大造丸、益血生膠囊等中成藥均含有紫河車(chē)。近年來(lái)，由于紫河車(chē)來(lái)源稀缺，藥材市場(chǎng)上充斥著使用豬、牛、羊的胎盤(pán)冒充紫河車(chē)的現(xiàn)象，大大降低了紫河車(chē)臨床用藥的安全性和有效性[2]。歷版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）收載的紫河車(chē)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，檢測(cè)指標(biāo)缺乏專(zhuān)屬性，不易鑒別藥材及其產(chǎn)品的真?zhèn)巍?/p>

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，經(jīng)中醫(yī)臨床配方后，供患者即沖即服的顆粒[3]。中藥干浸膏粉為中藥材經(jīng)提取、分離、濃縮后的浸膏干燥后所得的物料，也是制備中藥顆粒劑、片劑、膠囊劑等固體制劑的中間物料[4]。研究表明，目前配方顆粒存在制劑原料以次充好、藥材品種混用嚴(yán)重、產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣不一等問(wèn)題[5?7]。傳統(tǒng)的中藥飲片可以通過(guò)性狀鑒別進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，但中藥配方顆粒及浸膏通過(guò)加工制備后失去了原料的性狀特征，因此，需要建立針對(duì)中藥配方顆粒和干浸膏的合理、科學(xué)、快速、簡(jiǎn)便的檢驗(yàn)方法[8?9]。

與傳統(tǒng)鑒別方法相比，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)最大的特點(diǎn)是不受樣品形態(tài)限制，對(duì)于中藥材、中藥飲片乃至含有生藥原粉的中藥劑型均可應(yīng)用，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)[10]。李慧等[11]利用位點(diǎn)特異性PCR 方法成功鑒別了紅天麻、烏天麻及其雜交天麻。田娜等[12]建立的多重位點(diǎn)特異性PCR鑒別方法,可同時(shí)鑒別滬地龍和廣地龍。孟虎彪等[13]使用位點(diǎn)特異性PCR 技術(shù)建立了一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒定牛膝和川牛膝配方顆粒的方法。崔占虎等[14]建立了一種藥材水提液DNA 提取方法，并利用位點(diǎn)特異性PCR 方法鑒別斷腸草與金銀花類(lèi)藥材水提液基原。相關(guān)研究依據(jù)金銀花差異單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)建立了一種位點(diǎn)特異性PCR方法鑒定金銀花植物及其配方顆粒真?zhèn)蝃15?16]。

《中國(guó)藥典》2020 年版收載了分子生物學(xué)檢查法1001“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法”[17]，特異性PCR 鑒定已廣泛應(yīng)用于中藥材提取液、中成藥、貴細(xì)藥材、配方顆粒的基原鑒定中，不僅為特異性藥材的鑒別提供解決方法，也提高了臨床用藥的安全性。本文擬建立紫河車(chē)飲片、干浸膏粉及配方顆粒PCR 鑒別方法，為規(guī)范紫河車(chē)及其產(chǎn)品質(zhì)量提供檢測(cè)工具。

1 材料

1.1 儀器

Veriti?型PCR儀、GeneAmp 9700型PCR儀（美國(guó)Applied Biosystem 公司）；PTC?100 型PCR 儀、SYNGENE 型凝膠成像系統(tǒng)（Gene 公司）；TC?512型PCR儀（上海Techne公司）。

1.2 試藥

紫河車(chē)飲片（批號(hào)：ZHC001～013）及混偽品羊胎盤(pán)（批號(hào)：YTP001～029）由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供；豬（學(xué)名：Sus scrofa）購(gòu)于北京第五肉聯(lián)廠；牛（學(xué)名：Bos taurus）購(gòu)于鮮匯生鮮超市。憑證標(biāo)本經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心蔣超副研究員進(jìn)行形態(tài)鑒定后，保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。

紫河車(chē)干浸膏粉樣品由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，紫河車(chē)配方顆粒樣品購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，配方顆粒企業(yè)分別為A、B、C、D，見(jiàn)表1。

表1 紫河車(chē)實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源信息

Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒（美國(guó)promega 生物公司，批號(hào)：A2360）；DNeasy?Blood &Tissue Kit 試劑盒、QIAquick Nucleotide Removal Kit 試劑盒（德國(guó)凱杰生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為69504、28306）。

2×M5 SuperTaqPCR Master Mix（北京聚合美生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MF164?01）；rTaqDNA聚合酶（批號(hào)：R001B）、Mighty Amp DNA 聚合酶（批號(hào)：R071A）、TaqDNA 聚合酶（批號(hào)：M0273）均購(gòu)自大連TaKaRa 公司；Trans 2K DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BM101）。

2 方法

2.1 DNA提取

分別使用Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒、DNeasy?Blood&Tissue Kit 試劑盒、QIAquick Nucleotide Removal Kit 試劑盒，依據(jù)說(shuō)明書(shū)操作步驟提取紫河車(chē)飲片、干浸膏粉及配方顆粒的DNA。樣品模板DNA提取后，置-4 ℃保存。

2.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載中藥紫河車(chē)及混偽品牛、羊、豬COⅠ序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Premier Primer 5.0 設(shè)計(jì)鑒別引物覆蓋中藥紫河車(chē)COⅠ序列，篩選引物穩(wěn)定區(qū)間，使用BioEdit 軟件將紫河車(chē)引物穩(wěn)定區(qū)間與混偽品牛、羊、豬進(jìn)行對(duì)應(yīng)的序列對(duì)齊，識(shí)別穩(wěn)定區(qū)間內(nèi)差異SNP鑒別位點(diǎn)；使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)紫河車(chē)配方顆粒特異性鑒別引物（圖1）。ZHC492F：5′?AAACCCCCTGCCATAACC?3′；ZHC492R：5′?GAGGTTGCGGTCTGTTAGTAGTA?3′由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 紫河車(chē)特異性鑒別引物設(shè)計(jì)

2.3 PCR擴(kuò)增條件

使用上述特異性鑒別引物對(duì)紫河車(chē)飲片及其干浸膏粉、配方顆粒總DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，初始PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為25 μL，包含2×M5 SuperTaqDNA 聚合酶12.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA模板1 μL，用無(wú)菌雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足剩余體積。初始反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，55 個(gè)循環(huán)（94 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃終延伸5 min，15 ℃保溫。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物7 μL，點(diǎn)樣于溴化乙錠（EB）染色的1.5%瓊脂糖凝膠上，200 V 電壓條件下電泳8～10 min，置SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察。

分別考察退火溫度、循環(huán)次數(shù)、DNA 模板量、Taq酶種類(lèi)、Taq酶用量、PCR 儀型號(hào)等因素，確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，并使用最佳條件對(duì)紫河車(chē)飲片、干浸膏粉及配方顆粒樣品進(jìn)行PCR 鑒別，驗(yàn)證該體系是否能穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別紫河車(chē)樣品及其混偽品。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取方法考察

將2.1 項(xiàng)下DNA 提取物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒提取后擴(kuò)增效果最好，其提取的紫河車(chē)飲片、干浸膏粉及配方顆粒均能產(chǎn)生單一條帶（圖2）。

圖2 紫河車(chē)DNA提取方法考察

3.2 PCR鑒別條件考察

分別對(duì)PCR 鑒別的關(guān)鍵影響因素退火溫度、循環(huán)次數(shù)、DNA 模板質(zhì)量濃度進(jìn)行系統(tǒng)考察。結(jié)果顯示，當(dāng)退火溫度為60 ℃，循環(huán)數(shù)為33 次，DNA 模板質(zhì)量濃度100 mg·L-1時(shí)紫河車(chē)飲片、干浸膏粉、配方顆粒均可擴(kuò)增獲得約110 bp 單一特異性鑒別條帶，其混偽品及陰性對(duì)照均無(wú)條帶（圖3）。Taq酶種類(lèi)影響特異性鑒別結(jié)果，其中，2×M5 SuperTaqPCR 聚合酶效果最佳，紫河車(chē)、干浸膏粉及配方顆粒均有單一條帶，見(jiàn)圖4 A。不同型號(hào)PCR 擴(kuò)增儀對(duì)結(jié)果影響較小，使用4 種不同PCR 擴(kuò)增儀均能準(zhǔn)確鑒別紫河車(chē)飲片、干浸膏粉及配方顆粒（圖4 B）。

圖3 退火溫度、循環(huán)次數(shù)及DNA模板量對(duì)紫河車(chē)PCR鑒別結(jié)果的影響

圖4 Taq酶種類(lèi)和PCR儀對(duì)紫河車(chē)PCR鑒別結(jié)果的影響

3.3 方法適用性考察

使用篩選出的反應(yīng)條件，對(duì)所采購(gòu)的紫河車(chē)飲片、干浸膏粉、不同廠家的紫河車(chē)配方顆粒及豬、牛、羊混偽品進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)紫河車(chē)飲片、干浸膏粉及不同生產(chǎn)廠家的配方顆粒均產(chǎn)生約110 bp 的單一特異性條帶，混偽品和空白對(duì)照無(wú)條帶（圖5）。

圖5 紫河車(chē)PCR方法學(xué)適用性考察

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前對(duì)紫河車(chē)的鑒定研究主要針對(duì)紫河車(chē)飲片，如孔朝輝[18]詳細(xì)描述了紫河車(chē)的形態(tài)特征；張穗[19]通過(guò)對(duì)比正偽品胎盤(pán)組織的顯微特征，發(fā)現(xiàn)紫河車(chē)的顯微特征具有明顯差異點(diǎn)，可用于鑒別其正偽品；靳維榮等[20]通過(guò)薄層色譜法建立了適用于紫河車(chē)真?zhèn)舞b別的理化鑒別方法；陳俊等[21]基于紫河車(chē)及其混偽品種間COⅠ序列差異，建立了紫河車(chē)及其混偽品的鄰接樹(shù)，結(jié)果表明，基于COⅠ序列的DNA 條形碼可用于紫河車(chē)的真?zhèn)舞b別。而對(duì)于紫河車(chē)經(jīng)加工處理后的制品，如提取物、配方顆粒等，仍缺少準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的鑒定方法。

本研究通過(guò)紫河車(chē)與其偽品的COⅠ序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其特異性SNP 位點(diǎn)，并對(duì)直接影響鑒別特異性的PCR 退火溫度、循環(huán)次數(shù)、DNA 模板質(zhì)量濃度、Taq酶種類(lèi)等核心因素進(jìn)行考察，并依據(jù)最佳鑒別條件進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)適用性考察，建立了一種適用于紫河車(chē)、干浸膏粉及配方顆粒中藥基原真?zhèn)舞b別的方法。在紫河車(chē)、干浸膏粉及配方顆粒樣品中均能擴(kuò)出約110 bp 的單一特異性鑒別條帶，偽品羊胎盤(pán)、牛、豬均無(wú)條帶。使用建立的特異性鑒別方法對(duì)不同廠家生產(chǎn)的紫河車(chē)配方顆粒進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，28 批樣品均能檢出紫河車(chē)源性成分，表明本研究建立的紫河車(chē)特異性鑒別方法對(duì)配方顆粒具有適用性。