多菌聯(lián)合發(fā)酵對辣木發(fā)酵品質(zhì)和活性物質(zhì)的影響

鄂曉迪 ， 李家明 ， 張玉鵬 ， 汪騰蛟 ， 左舒月 ， 李夢梅 ， 沙國新

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西習(xí)緣辣木有限公司，廣西南寧 530000）

辣木（Moringa oleifera Lam.）為多年生熱帶落葉喬木，屬辣木科（Moringa）辣木屬（Moringa），亦被稱為鼓槌樹、奇跡樹（馬波等，2017），在我國南方地區(qū)大規(guī)模種植。辣木年產(chǎn)量高，辣木葉粗蛋白質(zhì)含量高且纖維含量低（許敏等，2016），目前已作為蛋白質(zhì)飼料應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。辣木的花、葉、籽、豆莢、根和莖均具有良好的營養(yǎng)價值和生理功效，如抗病毒、抗菌、消炎和抗?jié)兊茸饔茫‵alowo 等，2018），其用于畜禽養(yǎng)殖，有助于改善動物腸道健康、機(jī)體代謝能力和胴體品質(zhì)。宋曉牧（2012）研究發(fā)現(xiàn)， 黑麥草和紫花苜蓿以65:35 的比例進(jìn)行青貯，發(fā)酵品質(zhì)和青貯效果最為理想，可作為較佳的混貯配比模式。 辣木稈和辣木莖葉的營養(yǎng)價值與黑麥草和紫花苜蓿的營養(yǎng)價值接近， 因此將辣木莖葉粉與辣木稈粉按2：1 的比例混合可以提高辣木的利用價值和青貯品質(zhì)。

辣木中雖含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)， 但同時也含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子如單寧、 植酸和皂苷等（Oloke等，2020）， 其會降低畜禽對飼料的利用效果。 目前，針對提高飼用辣木的利用率有很多措施，最為常見的是將辣木青貯發(fā)酵， 可以提高其營養(yǎng)價值和活性成分， 降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量。 王田田等（2020）發(fā)現(xiàn)，多菌青貯比單一菌種青貯效果更為理想。因為黑曲霉在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、木質(zhì)素降解酶等多種酶（朱玉霞等，2019），可以高效降解抗?fàn)I養(yǎng)因子。釀酒酵母可以產(chǎn)生多種酶類， 與黑曲霉有很好的協(xié)同作用（王楠等，2015）。乳酸菌可提高發(fā)酵過程中乳酸的含量，降低pH 和氨態(tài)氮含量，可以提高發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性（Mugabe 等，2019）。 所以本試驗選取黑曲霉、 釀酒酵母和乳酸菌作為菌種進(jìn)行發(fā)酵，以辣木稈粉和莖葉粉作為基質(zhì)，探討多菌聯(lián)合發(fā)酵對辣木的活性成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響，以期為新型辣木飼料的生產(chǎn)提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 辣木莖葉粉、辣木莖稈粉由廣西習(xí)緣辣木有限公司提供。 黑曲霉（FCCC 114002）購自山東和眾康源生物科技有限公司， 釀酒酵母（GGSF16）來自本實驗室保藏菌株，乳酸菌購自廣東順德尚川生物科技有限公司。 辣木葉粉與辣木莖稈粉按照2:1 混合，其營養(yǎng)成分、活性物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量見表1。

表1 青貯原料營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 主要試劑和儀器 濃硫酸、硫酸銅、丙酮、十二烷基硫酸鈉、 十六烷三甲基溴化銨等均購自北京索萊寶科技有限公司。 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；K9860 全自動凱氏定氮儀， 濟(jì)南海能；A200i 半自動纖維分析儀， 美國ANKOM Technology；恒溫水浴鍋（HH-2），常州普天儀器制造有限公司； 紫外分光光度計 （SP-756）， 上海光譜儀器有限公司；Centrifuge 5804R離心機(jī)， 德國艾本德股份公司；N-1100S-WD 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；干燥箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 黑曲霉和釀酒酵母分別接種于PDA 固體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，將乳酸菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。

1.3.2 種子液制備 將黑曲霉和釀酒酵母用接種環(huán)重復(fù)接種PDA 固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌絲鋪滿整個培養(yǎng)基，用無菌純化水沖洗孢子；4 層擦鏡紙過濾之后用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)， 用無菌純化水將其濃度調(diào)制后用血細(xì)胞計1×107cfu/mL。 乳酸菌培養(yǎng) 12 h 后，8000 r/min 離心 10 min， 調(diào)整細(xì)菌懸液菌落數(shù)約為1×107cfu/mL。

1.3.3 發(fā)酵過程與樣品收集 將辣木莖葉粉和辣木稈粉混勻后，接種活化后的黑曲霉、釀酒酵母和乳酸菌，菌種混合比例為1:1:1，濃度為1×107cfu/mL，添加量為0.1%。有氧階段發(fā)酵于塑料瓶中，用雙層紗布覆蓋瓶口，放于無菌培養(yǎng)箱中，溫度25 ℃、濕度 75%，每 6 h 搖晃一次，于 24、48、60、72 h 取樣檢測。 有氧發(fā)酵結(jié)束后將其轉(zhuǎn)入真空袋中，抽至真空放于室內(nèi) 28 ～ 30 ℃發(fā)酵 3、5、7、9 d，取樣檢測。每個時間點打開4個樣品檢測各項指標(biāo)。

1.4 發(fā)酵樣品的測定

1.4.1 營養(yǎng)成分測定 取適量各組發(fā)酵樣品，65 ℃ 烘干至恒重，粉碎后過40 目金屬篩，密封保存?zhèn)溆谩?采用索氏提取法測定粗脂肪（EE）的含量，采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)（CP）含量，采用濾袋法測定粗纖維（CF）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。

1.4.2 活性成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子測定 黃酮含量測定參照陳慶鑰等（2020）方法，多糖含量測定參考楊玲等（2019）的方法進(jìn)行，多酚的測定參照沈慧等（2016）的方法進(jìn)行，植酸含量的測定參照李振剛（2012）的方法，參照 Makkar（2003）的方法測定水解單寧的含量。

1.4.3 發(fā)酵品質(zhì)測定 取各組發(fā)酵樣品10 g，加入90 mL 無菌林格氏液，攪拌均勻，靜置30 min 后，用兩層紗布過濾， 濾液用pH 計測定其pH， 用苯酚-次氯酸鈉法測定氨態(tài)氮含量（馬莉等，2020）。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用 Microsoft Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理， 采用 SPSS 24.0 進(jìn)行差異顯著性分析，試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P ＜0.05表示為差異顯著，P ＜0.01 表示為差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 多菌聯(lián)合發(fā)酵對辣木莖葉發(fā)酵品質(zhì)的影響 由表2 可知，有氧發(fā)酵階段，pH 隨著時間推移，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢， 各時間段表現(xiàn)為差異極顯著（P ＜0.01）。氨態(tài)氮含量在48 h 降到最低值，48 ～60 h 升到最高值，在 72 h 又逐漸降低，各組間無顯著差異。 在厭氧發(fā)酵階段，各時間段的pH和氨態(tài)氮含量無顯著差異。

表2 多菌聯(lián)合發(fā)酵對pH 和氨態(tài)氮的影響

2.2 多菌聯(lián)合發(fā)酵對辣木莖葉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響 由表3 可知，有氧發(fā)酵階段，隨著時間的增加，CP 的含量逐漸升高，48 ～ 72 h 的 CP 含量較24 h 顯著升高 （P ＜ 0.05）。 72 h 的 ADF 含量與24 h 相比顯著上升（P ＜ 0.05），其中 48 ～ 60 h 與24 h 差異不顯著（P ＞ 0.05）。 而隨著時間的增加EE、NDF 和干物質(zhì)損失無顯著變化（P ＞ 0.05）。 厭氧階段，CP 含量各時間段差異極顯著（P ＜ 0.01），在第 3 ～ 7 天，CP 含量急速上升， 直至第 7 天達(dá)到峰值20.34%，在第9 天時又呈現(xiàn)下降趨勢。干物質(zhì)損失量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增多，發(fā)酵第5 ～9 天的干物質(zhì)損失較第3 天顯著上升 （P ＜0.05），而 5 ～ 9 d 差異不顯著 （P ＞ 0.05）。 各時間段 EE、NDF 和 ADF 含量無顯著變化（P ＞ 0.05）。

表3 多菌聯(lián)合發(fā)酵各時間段常規(guī)營養(yǎng)成分的變化 %

2.3 多菌聯(lián)合發(fā)酵對辣木莖葉活性成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響 由表4 可知， 在有氧階段，48 h 和60 h 黃酮含量有所提升， 但與24 h 的黃酮含量差異不顯著（P ＞0.05），在 72 h 黃酮含量達(dá)到最高值11.20 g/kg，與 24 h 呈差異顯著水平（P ＜ 0.05）。單寧的含量隨著時間推移，含量逐漸降低。 在48 h 時單寧含量有所降低，但與24 h 差異不顯著（P ＞0.05），在60 ～72 h 單寧含量趨于穩(wěn)定， 與24 h 相比顯著降低（P ＜ 0.05）。 植酸含量持續(xù)升高，48 ～ 72 h 的植酸含量差異不顯著（P ＞0.05），但與 24 h 相比呈現(xiàn)差異顯著水平（P ＜0.05）。 多糖和多酚的含量在各時間段無顯著差異。 在厭氧發(fā)酵階段，單寧的含量在第7 ～9 天呈現(xiàn)上升趨勢，與3 ～7 d 差異顯著（P ＜ 0.05）。 黃酮、多糖、多酚和植酸的含量在各時間段無顯著差異性（P ＞ 0.05）。

表4 多菌聯(lián)合發(fā)酵各時間段活性成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化 g/kg

3 討論

3.1 多菌聯(lián)合發(fā)酵過程中辣木莖葉發(fā)酵品質(zhì)的變化 pH 和氨態(tài)氮是評價發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。 本試驗有氧發(fā)酵 24 ～ 48 h，pH 迅速下降，在48 ～ 72 h，pH 逐漸升高。 pH 迅速下降可能是在發(fā)酵過程中可溶性碳水化合物（WSC）為乳酸提供了營養(yǎng)物質(zhì)，大量產(chǎn)酸，從而導(dǎo)致pH 下降（張文潔等，2016）。 隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸含量逐漸下降，從而引起pH 升高。 在厭氧階段加入乳酸菌，使飼料的pH 下降。 而發(fā)酵飼料中產(chǎn)生的氨氮，易溶于水，與水發(fā)生反應(yīng)形成氨水呈堿性，使pH 有所上升中和了乳酸降低pH 的作用。這可能是厭氧階段pH 相對穩(wěn)定的原因。

氨態(tài)氮與總氮的比值可反映青貯飼料中蛋白質(zhì)和氨基酸的分解程度， 氨態(tài)氮含量越低說明蛋白質(zhì)分解越少青貯品質(zhì)越好。由于乳酸菌的添加，pH 降低從而抑制有害菌的繁殖，保護(hù)營養(yǎng)物質(zhì)不被分解和破壞，如 CP 等（胡向東等，2014）。 因此隨著乳酸菌的添加， 飼料發(fā)酵過程中的氨態(tài)氮含量有下降的趨勢。

3.2 多菌聯(lián)合發(fā)酵過程中辣木莖葉常規(guī)營養(yǎng)成分的變化 CP、CF、EE 等是表示飼料的重要常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)。 發(fā)酵飼料中的粗蛋白質(zhì)不僅包括飼料中原有的粗蛋白質(zhì)， 也包含有微生物在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為菌體蛋白或者分泌蛋白。CP 在黑曲霉和釀酒酵母菌的協(xié)同發(fā)酵下粗蛋白質(zhì)含量有所提高，在24 ～72 h 上升較為明顯，在厭氧條件下，乳酸菌的加入提高了飼料蛋白質(zhì)的含量， 并在第7 天達(dá)到最高值。 可能是由于發(fā)酵過程中，微生物通過利用發(fā)酵基質(zhì)將其轉(zhuǎn)化為細(xì)菌蛋白或分泌蛋白（張思宇2017），從而提高了發(fā)酵處理后底物的粗蛋白質(zhì)含量。 同時，發(fā)酵過程中消耗了一定量的碳水化合物等物質(zhì)，釋放出能量和二氧化碳，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物總量減少以及底物中蛋白質(zhì)含量的增加。

辣木除了含有較高CP 之外也含有纖維素、木質(zhì)素、果膠等難以被動物消化吸收的物質(zhì)，其會阻礙動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用。 而釀酒酵母菌可以產(chǎn)生21 余種酶類（王楠等，2015），其中內(nèi)切葡聚糖酶、 木聚糖酶和果膠酶等可以有效降解這些抗?fàn)I養(yǎng)因子（朱玉霞等，2019），這與黑曲霉有很好的協(xié)同作用。 但在本試驗中，NDF 和ADF 在有氧階段均有不同程度的升高， 可能是發(fā)酵過程中碳水化合物和干物質(zhì)相對損失而引起的。

3.3 多菌聯(lián)合發(fā)酵過程中辣木莖葉活性成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化 辣木葉中富含黃酮和多糖等活性成分， 辣木中的黃酮具有清除人體內(nèi)自由基、抗氧化、降低血糖血脂的藥理作用。 辣木中黃酮的含量較高，有研究發(fā)現(xiàn)辣木可提取的總黃酮平均含量為4.27%（張善添等，2017）。 辣木多糖是辣木有效活性成分之一。有研究表明，辣木多糖有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、降糖等功效（梁鵬等，2013）。除了含有黃酮和多糖這些活性成分以外，辣木也含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子。然而影響辣木活性成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子的因素也有很多，如空氣、溫度、pH 等。

本研究中，辣木黃酮的含量，有氧階段在黑曲霉和釀酒酵母菌的作用下，黃酮含量逐漸上升，在72 h 時達(dá)到峰值，厭氧階段加了乳酸菌，雖然黃酮含量有所增加，但變化并不明顯。 多糖的含量在厭氧階段和有氧階段差異均不顯著， 但厭氧階段在乳酸菌的作用下含量明顯比有氧階段高。 黃酮含量提高可能是黑曲霉和釀酒酵母菌聯(lián)合發(fā)酵，能夠產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶等多種酶類，破壞植物細(xì)胞壁， 將黃酮類活性物質(zhì)從纖維素和蛋白質(zhì)等聚合物中釋放出來， 有利于辣木黃酮的釋放（郭志鵬等，2020），而乳酸菌的添加有助于促進(jìn)多糖的釋放。 有氧階段在黑曲霉和酵母菌的作用下單寧含量持續(xù)降低， 厭氧階段在第7 天時達(dá)到最低值，但在第9 天又呈上升趨勢。 因為黑曲霉和釀酒酵母菌能產(chǎn)生降解單寧的酶類（李鳳玲等，2018；孫宏等，2018），這可能是單寧降低的原因。而在第9 天單寧含量上升的原因，可能與pH 在第9 天上升有關(guān)。植酸的含量在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)上升趨勢，影響植酸的因素有很多，可能是由于在此發(fā)酵環(huán)境條件下，植酸酶的活性受到了限制。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)， 在有氧階段黑曲霉和酵母菌協(xié)同發(fā)酵有利于活性物質(zhì)黃酮的釋放和營養(yǎng)物質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量的提升，以及抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧的降解。在厭氧發(fā)酵階段， 乳酸菌有利于粗蛋白質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)的提升。 綜合試驗結(jié)果， 可以看出有氧發(fā)酵48 h 和厭氧發(fā)酵7 d 時發(fā)酵品質(zhì)最佳， 可以得到高活性成分、高蛋白和低抗?fàn)I養(yǎng)因子的發(fā)酵飼料。