翻堆措施對傳統(tǒng)堆肥理化指標(biāo)及微生物種群的影響

王 博，安 昊，張婷婷，張 君，武生財(cái)，李煥春

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與檢測技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.五原縣農(nóng)牧業(yè)推廣中心，內(nèi)蒙古五原 015100）

早在公元前202年，我國就已經(jīng)有了畜糞和農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行發(fā)酵并用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的文字記載[1]，我國農(nóng)村地區(qū)也有將秸稈、落葉、野草、動物糞便及墊圈料等農(nóng)業(yè)廢棄物通過堆漚的方式制成有機(jī)肥料的習(xí)慣[2]。但是，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中偏施化肥會導(dǎo)致有機(jī)肥料施用比例逐年下降。偏施化肥不僅帶來了眾多環(huán)境污染問題，還導(dǎo)致耕地肥力不斷下降[3-7]。發(fā)達(dá)國家采取了很多技術(shù)措施與政策鼓勵(lì)將農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行處理后用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，以解決化肥過量施用帶來的環(huán)境污染問題[8]，其中好氧堆肥技術(shù)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)廢棄物高效處理與資源化利用領(lǐng)域。近年來，我國也不斷出臺關(guān)于耕地質(zhì)量提升的相關(guān)政策，有機(jī)肥施用量在未來一段時(shí)間內(nèi)將不斷增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年產(chǎn)生各類農(nóng)業(yè)廢棄物約38 億t[9]，有相當(dāng)比例的農(nóng)業(yè)廢棄物僅采用了簡單的晾曬、堆漚等方法進(jìn)行處理。這些處理方法普遍發(fā)酵不徹底、發(fā)酵周期長，且處理后的產(chǎn)品存在質(zhì)量不穩(wěn)定、無害化程度低等問題[10]。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2017年組織編撰的《中國有機(jī)肥企業(yè)調(diào)研報(bào)告》表明，目前，我國有機(jī)肥企業(yè)存在規(guī)模小、設(shè)施相對簡陋、原料摻雜現(xiàn)象嚴(yán)重、產(chǎn)品質(zhì)量低等問題。然而受限于我國有機(jī)肥行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)體系仍不完善及技術(shù)瓶頸難以突破，工廠化堆肥技術(shù)的產(chǎn)量與處理效率在短時(shí)間內(nèi)無法迅速提高。因此，在未來的一段時(shí)間內(nèi)，傳統(tǒng)堆漚方式仍然是就近處理有機(jī)廢棄物的主要技術(shù)與途徑之一，改進(jìn)傳統(tǒng)堆漚技術(shù)與提高傳統(tǒng)堆漚產(chǎn)品質(zhì)量已成為急需解決的農(nóng)業(yè)廢棄物處理問題，目前關(guān)于堆肥工藝研究多集中于反應(yīng)器或槽式堆肥工藝方面，針對傳統(tǒng)堆漚技術(shù)與微生物種群的研究較少。本研究進(jìn)行了在傳統(tǒng)堆漚技術(shù)中增加翻堆措施的試驗(yàn)，旨在優(yōu)化傳統(tǒng)堆漚技術(shù)，提高傳統(tǒng)堆漚肥料質(zhì)量，為促進(jìn)農(nóng)村廢棄物高效處理提供技術(shù)支撐，為耕地質(zhì)量提升提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)原料

試驗(yàn)周期60 d，采用奶牛糞與小麥秸稈為供試原料，原料性質(zhì)見表1。

表1 試驗(yàn)原料性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將奶牛糞與小麥秸稈按3∶1 比例混合，初始含水率約為66%，堆體尺寸為5.0 m 長×2.0 m 寬×1.4 m高（圖1），試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)處理，詳細(xì)設(shè)計(jì)見表2，所有處理設(shè)3 次重復(fù)。采用鏟車進(jìn)行物料混合與翻堆。

表2 試驗(yàn)處理設(shè)置

圖1 堆體尺寸與堆肥現(xiàn)場俯視圖

1.3 取樣

堆肥發(fā)酵過程中進(jìn)行取樣檢測，取樣時(shí)間為堆肥第0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、40、50、60 天；取樣方法與測溫方式見圖2；取樣時(shí)先將樣品混合，然后采用四分法多次分取樣品，共2 kg。樣品分為3 份，1 份保存在4 ℃冰箱用于DNA 提取，測序樣品保存于-80 ℃冰箱；1 份進(jìn)行自然風(fēng)干，粉碎后用于理化性質(zhì)測定；1 份保存于-80 ℃冰箱待用。

圖2 取樣與測溫方法

1.4 測定方法

溫度采用感應(yīng)探頭（PT100，USA）測定；pH 值采用pH 測定儀（PHS-3C，中國）測定；EC 值采用電導(dǎo)儀（DDSJ-319L，中國）測定；全氮（TN）、有機(jī)質(zhì)、水分及發(fā)芽指數(shù)指標(biāo)參考《有機(jī)肥料》（NY/T 525—2021）方法測定。雜草種子滅活采用雜草種子發(fā)芽率測定：選用奶牛養(yǎng)殖飼料中常用的5 種牧草種子紫花苜蓿（豆科），菊苣（菊科），蘇丹草（禾本科），黑麥草（禾本科，青貯飼料），籽粒莧（莧科）；耕地常見雜草種子1種：狗尾草（禾本科）。將上述6 種種子約500 粒裝進(jìn)孔度為0.15 mm 的尼龍網(wǎng)袋，將網(wǎng)袋放進(jìn)肥堆的中心，并在網(wǎng)袋的扎口處系一條尼龍繩并引至在堆體外以方便種子采樣。對照組（T1 與T2）在堆肥開始前將裝有雜草種子的尼龍袋放入堆體中心，在第1、2、3、4、6、9、12、15、18、21、24、30 天取種子樣品；試驗(yàn)組（T3 與T4）在堆體溫度上升至40 ℃時(shí)，將裝有雜草種子的尼龍袋放入堆體中心。在堆體溫度達(dá)到40 ℃后的第12、24、36、48、60、72 小時(shí)取種子樣品。每次取出35～40 粒種子測定發(fā)芽率[11]。堆肥樣品總DNA 采用Soil Fast DNA 快速試劑盒提?。∕P，Biomedicals，Santa Ana，Carlsbad，CA，United States），并進(jìn)行Illumina HiSeq 高通量測序[12]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，微生物種群豐度、多樣性通過Galaxy 平臺（http：//www.freebioinfo.org/）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖（結(jié)果分析的序列要求為長度＞300 bp，沒有不明確的堿基“N”，平均堿基質(zhì)量得分＞30，最后生成每個(gè)樣品的OTU 用于結(jié)果分析[13]）。

2 結(jié)果與分析

2.1 翻堆措施對堆肥過程理化指標(biāo)的影響

在堆肥過程中，溫度是反映有機(jī)物分解和微生物生長的重要因素。由圖3a 可知，在采用翻堆措施后，試驗(yàn)組T3、T4 處理在第3 天至第21 天的溫度均與對照組（T1 與T2）呈極顯著差異（P＜0.01），T4 與T3 處理在第3 天至第21 天的溫度無顯著差異（P＞0.05）。T4 處理的堆體最高溫度與升溫速度高于對照組（T1 和T2），且高溫期（≥55 ℃）持續(xù)時(shí)間得到延長。T4 處理最高溫度可達(dá)到61.33 ℃，而T3 處理最高溫度為56.67 ℃，對照組（T1 和T2）的最高溫度僅為23.00 ℃和36.67 ℃。T4 和T3 處理的高溫期（≥55 ℃）持續(xù)時(shí)間分別為9 d 和3 d，說明較高的翻堆頻率能夠提高堆體的最高溫度與延長高溫期持續(xù)時(shí)間。由圖3b 可知，試驗(yàn)組（T3 和T4）的水分去除率分別達(dá)到33.84%和37.48%。對照組（T1 和T2）由于堆體溫度較低，水分去除率僅為5.62%和20.64%。堆肥過程中所有處理的全氮含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，由圖3c 可知，試驗(yàn)組（T3 和T4）的全氮含量呈現(xiàn)下降趨勢，對照組（T2）的全氮含量呈現(xiàn)上升趨勢。由圖3d 可知，堆肥過程中的有機(jī)質(zhì)含量整體處于下降趨勢，其中，T4 處理的有機(jī)質(zhì)含量下降幅度最大，降幅達(dá)到39.81%；其次是T3 處理，降幅為31.15%；對照組（T1 和T2）的有機(jī)質(zhì)含量沒有明顯降低，降幅僅為2.52%和2.96%。相關(guān)研究表明，EC 值高于4 ms/cm時(shí)，堆肥產(chǎn)物有可能具有植物毒性，并對作物生長產(chǎn)生影響，因此該堆肥產(chǎn)物不適用于制作成有機(jī)肥產(chǎn)品并進(jìn)行農(nóng)田施用[14]。由圖3e 可知，經(jīng)過60 d 發(fā)酵后，所有處理堆肥產(chǎn)物的EC 值未超過4 ms/cm，說明所有處理的堆肥產(chǎn)物不存在影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的隱患，T2 處理堆肥產(chǎn)物的EC 值顯著（P<0.05）高于T1、T3 和T4 處理；與對照組相比，試驗(yàn)組的產(chǎn)物EC 值較低。堆肥過程中所有處理的pH 值變化規(guī)律相似，由圖3f 可知，在堆肥開始的前9 d pH 值增加，然后開始下降，到堆肥第25 天左右開始波動。所有處理的堆肥產(chǎn)物pH 值均為7.8～8.3，T4 處理的最終pH 值為8.15。上述結(jié)果表明，翻堆措施能夠提高堆體的最高溫度，延長高溫期持續(xù)時(shí)間，有效降低堆體水分含量，對大分子有機(jī)物具有良好的降解效果。

圖3 堆肥過程中溫度（a）、水分（b）、全氮（c）、有機(jī)質(zhì)（d）、EC 值（e）及pH 值（f）變化規(guī)律

2.2 翻堆措施對堆肥過程腐熟度的影響

腐熟度是評價(jià)堆肥產(chǎn)物是否完成好氧發(fā)酵的重要指標(biāo)，目前評價(jià)堆肥產(chǎn)物的腐熟度一般采用碳氮比與種子發(fā)芽指數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)[15-16]。由圖4a 可知，經(jīng)過60 d 發(fā)酵后，堆肥物料的C/N 整體呈下降趨勢，試驗(yàn)組（T3 和T4）C/N 分別由初始的19.07 和15.50 下降至13.51 和10.55，基本達(dá)到了堆肥腐熟標(biāo)準(zhǔn)；而對照組T1 處理的C/N 下降較慢，堆肥結(jié)束后C/N為15.44。由圖4b 可知，與對照組相比，試驗(yàn)組的發(fā)芽指數(shù)顯著（P<0.05）提高，對照組（T1 和T2）的發(fā)芽指數(shù)相對較低，堆肥60 d 后發(fā)芽指數(shù)仍低于70%；而采用翻堆措施的試驗(yàn)組（T3 和T4）在發(fā)酵第30 天的發(fā)芽指數(shù)分別達(dá)到84.90%和73.32%。因此，翻堆措施對堆肥產(chǎn)品的腐熟度有積極影響。

圖4 堆肥過程中C/N（a）和發(fā)芽指數(shù)（b）變化規(guī)律

2.3 翻堆措施對堆肥過程無害化程度的影響

雜草種子滅活率是衡量堆肥成品的安全限定指標(biāo)，而堆體溫度是降低雜草種子發(fā)芽率的有效措施[16]。研究表明，當(dāng)堆體溫度達(dá)到50 ℃并保持5 d 以上時(shí)，可以有效殺滅各種類型的雜草種子[11]。為了研究堆體溫度在≥40 ℃條件時(shí)對雜草種子的滅活效果，本次試驗(yàn)設(shè)置了＜40 ℃（圖5a）及≥40 ℃（圖5b）兩種堆體溫度條件。由圖5a 可知，在對照組（T1 與T2）中，由于堆體最高溫度均未超過40 ℃，雜草種子在堆體溫度＜40 ℃條件下未能實(shí)現(xiàn)100%的滅活，在堆體發(fā)酵進(jìn)行到第28 天時(shí)，籽粒莧的發(fā)芽率仍然達(dá)到67.5%，狗尾草發(fā)芽率為9.2%，表明傳統(tǒng)堆肥存在將雜草種子帶入土壤的隱患[17]。由圖5b 可知，與對照組相比，試驗(yàn)組的堆體溫度在堆肥開始后第3 天即可達(dá)到≥40 ℃，在第6 天才達(dá)到50 ℃以上，而試驗(yàn)組在試驗(yàn)第5 天雜草種子發(fā)芽率為0。試驗(yàn)結(jié)果表明，翻堆措施能夠通過提高堆體溫度從而實(shí)現(xiàn)對堆體中雜草種子的滅活，且當(dāng)堆體溫度達(dá)到40 ℃以上并持續(xù)2 d 時(shí)，即可實(shí)現(xiàn)對雜草種子的全部滅活。

圖5 不同溫度條件下雜草種子發(fā)芽率

2.4 翻堆措施對堆肥過程微生物種群豐度及多樣性的影響

堆肥中的微生物群落在調(diào)節(jié)堆肥過程與堆肥產(chǎn)品質(zhì)量方面起到了重要作用[18]。對所有的堆肥樣品進(jìn)行16S rRNA 高通量測序得到微生物組數(shù)據(jù)。從156 個(gè)樣本中共獲得27 582 125 條16S rRNA 序列，每個(gè)樣本有21 954 到789 581 個(gè)序列。這些序列分為3 254 184 個(gè)OTU（＞97%同一性）。由圖6 可知，堆肥樣品中大多數(shù)微生物物種在門水平上屬于Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Chloroflexi（綠灣菌門）、Euryarchaeota（廣古菌門）和Deinococcus-Thermus（異常球菌-棲熱菌門）。與對照組（T1）相比，翻堆措施能夠提升Deinococcus-Thermus 的相對豐度，采用翻堆措施的條件下，T3 和T4 處理的相對豐度分別從1.52%和1.33% 提升到11.54%和12.48%，在堆肥開始后的第6 天，T4 處理的相對豐度提升至8.35%，而同期沒有進(jìn)行翻堆措施的對照組（T2）相對豐度僅為2.89%。Chloroflexi 的相對豐度也得到有效提高，T3 和T4 處理的相對豐度分別從1.98%和2.54% 提升到24.35%和19.54%。結(jié)果表明，采取翻堆措施的堆體中Deinococcus-Thermus 和Chloroflexi 的相對豐度較高。Chloroflexi的相對豐度增加，表明堆體中Chloroflexi 的微生物代謝活性持續(xù)增強(qiáng)，能夠在堆肥升溫期對不同類型的碳源進(jìn)行降解，從而實(shí)現(xiàn)堆體的快速升溫[19]。而Deinococcus-Thermus 能夠在堆體進(jìn)入高溫期后繼續(xù)對大分子有機(jī)物進(jìn)行降解[20]。

圖6 不同處理微生物種群豐度（門水平）

大多數(shù)微生物物種在綱水平上屬于Gammaproteobacteria（γ 變形桿菌綱）、Actinobacteria（放線菌綱）、Bacteroidia（擬桿菌綱）、Flavobacteriia（黃小桿菌綱）、Clostridia（梭菌綱）、Anaerolineae（厭氧繩菌綱）、Bacilli（桿菌綱）、Deinococci（異常球菌綱）、Alphaproteobacteria（α 變形桿菌綱）和Methanomicrobia（甲烷微菌綱）等。由圖7 可知，翻堆措施能夠提高Deinococci 的相對豐度，T3 處理由1.12%提升至4.85%、T4 處理由0.89%提升至7.18%，而沒有采用翻堆措施的T2 處理僅從0.38% 提升至2.14%。對照組T2 處理堆體中Methanomicrobia 的相對豐度較高，說明堆體內(nèi)部出現(xiàn)了厭氧發(fā)酵，堆體會產(chǎn)生甲烷。上述結(jié)果表明，翻堆措施能夠促進(jìn)堆體中土著微生物的活性，從而促進(jìn)土著微生物對大分子有機(jī)物的降解。

圖7 不同處理微生物種群豐度（綱水平）

α 多樣性指數(shù)通過比較不同處理的Shannon-Wiener、Inverted Simpson 和Pielous Eveness 指數(shù)確定堆體中土著微生物多樣性[21]。由圖8 可知，翻堆措施能夠顯著影響堆體中細(xì)菌α 多樣性，4 個(gè)處理的細(xì)菌群落豐度、多樣性和均勻度在整個(gè)堆肥周期中呈現(xiàn)出相同的趨勢。添加輔料但不采取翻堆措施（T2）處理的微生物種群多樣性和均勻度在堆肥過程中最高。在添加輔料的基礎(chǔ)上采取翻堆措施（T3 和T4），會導(dǎo)致微生物細(xì)菌群落多樣性有所下降，這是因?yàn)槎洋w溫度的升高會降低中溫與低溫微生物的相對豐度，但與T1 處理相比，堆體中細(xì)菌微生物種群豐度、多樣性和均勻度仍然得到提高。

圖8 微生物細(xì)菌α 多樣性

3 結(jié)論與討論

本研究表明，在堆肥過程中采用原料配比與翻堆措施，對堆體的升溫速度、高溫持續(xù)時(shí)間、水分含量、全氮、有機(jī)質(zhì)及發(fā)芽指數(shù)均產(chǎn)生了影響，與相關(guān)研究結(jié)果一致。堆肥開始時(shí)需調(diào)節(jié)初始物料C/N，適宜的C/N 能夠有利于堆肥，一般情況下適宜的C/N范圍為25∶1～30∶1[22]。但相關(guān)研究也表明，低C/N 物料（15∶1～20∶1）的堆體溫度也可以達(dá)到60 ℃以上[23-25]，本研究物料的初始C/N 較低，通過在堆肥過程中采用翻堆措施實(shí)現(xiàn)對堆體的氧氣補(bǔ)充，能夠滿足堆體內(nèi)土著微生物對氧氣的需求。堆體中土著微生物在對大分子有機(jī)物降解過程中會產(chǎn)生更多代謝熱量，從而使低C/N 物料也能夠快速升溫與延長高溫期持續(xù)時(shí)間[26]。翻堆措施還能夠促進(jìn)堆體的生物熱能效率[27]，使堆體通過微生物代謝熱快速去除水分[28]。同時(shí)，翻堆措施會提高堆體內(nèi)微生物對不同類型有機(jī)物的降解能力，并消耗更多的氮源物質(zhì)，從而導(dǎo)致堆肥過程中的全氮與有機(jī)質(zhì)含量降低[29-30]。同時(shí)，堆肥產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)腐熟是由于堆體內(nèi)有機(jī)物經(jīng)過微生物礦化和腐殖化達(dá)到穩(wěn)定的結(jié)果，因此腐熟度較高的堆肥產(chǎn)物會提高發(fā)芽指數(shù)[31]。而傳統(tǒng)堆漚由于堆體結(jié)構(gòu)較差，并且沒有為堆體補(bǔ)充氧氣，導(dǎo)致堆體內(nèi)微生物活性較低，從而使堆體無法升溫、水分去除效率低、全氮含量較高、有機(jī)質(zhì)降解效率及發(fā)芽指數(shù)較低。

研究表明，好氧發(fā)酵在不同階段的優(yōu)勢微生物種群是不同的，隨著堆體進(jìn)入高溫期，Deinococci 的相對豐度得到增加，這類微生物通常在堆肥的高溫階段發(fā)現(xiàn)[32]，高溫期堆體提高了嗜熱微生物的豐度與活性，增強(qiáng)了嗜熱微生物代謝功能，減少了低溫或中溫微生物的相對豐度，使堆體在高溫期能夠繼續(xù)對有機(jī)物進(jìn)行降解，但堆體中細(xì)菌多樣性也會降低[33]。然而，采用翻堆措施的堆體中仍然存在Anaerolineae，說明即使采取了原料配比與翻堆措施，堆體中仍存在局部厭氧發(fā)酵的現(xiàn)象。

本研究表明，目前對照組沒有高溫發(fā)酵過程，發(fā)芽指數(shù)較低，同時(shí)微生物組成中厭氧微生物相對豐度較高。而采用較高翻堆頻率的試驗(yàn)組能夠提高堆體的最高溫度并延長高溫期持續(xù)時(shí)間，有利于去除堆體中的水分，降低堆肥成品中全氮和有機(jī)質(zhì)含量，提高堆肥成品的腐熟度（發(fā)芽指數(shù)為77.11%，C/N 降低至10.55）及無害化程度（雜草種子發(fā)芽率為0），以及改變堆體中細(xì)菌種群組成，降低堆體中細(xì)菌種群多樣性，增加嗜熱菌的相對豐度，使堆肥產(chǎn)品能夠滿足《畜禽糞便堆肥技術(shù)規(guī)范》（NY/T 3442—2019）的要求。