井岡霉素的發(fā)酵配方優(yōu)化研究

周海平 錢江偉

摘要：以現(xiàn)有的井岡霉素工業(yè)生產(chǎn)菌種S#菌株為研究對象，在現(xiàn)有生產(chǎn)配方的基礎(chǔ)上，調(diào)整發(fā)酵碳、氮源品種和配比，在設(shè)備、種齡、種量、空氣流量等工藝條件相同的情況下，通過搖瓶和中試罐試驗，根據(jù)試驗實測值，探究井岡霉素工業(yè)生產(chǎn)的最佳碳、氮源原料與配比，實現(xiàn)生產(chǎn)配方的優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：井岡霉素;種子;發(fā)酵配方;優(yōu)化

井岡霉素是通過吸水鏈霉菌井岡變種發(fā)酵產(chǎn)生的一種多元混和物，有效成分為井岡霉素A[1]，主要用于防治水稻、小麥紋枯病和棉花、蔬菜、豆類等農(nóng)作物的立枯病以及葡萄等果樹的黑粉病等，是我國迄今為止應(yīng)用最早、使用最廣的廉價高效農(nóng)用抗生素藥物，深受農(nóng)戶歡迎[2]。近年來，井岡霉素在其他領(lǐng)域（如醫(yī)藥等）也有廣泛的應(yīng)用，井岡霉素的生物合成中間體是制造治療糖尿病藥物的原料之一，經(jīng)濟價值很高[3]。為了迎合市場需求，研究生物合成井岡霉素生產(chǎn)配方優(yōu)化，提高井岡霉素發(fā)酵水平，降低成本，提高經(jīng)濟效益。

1 試驗

1.1 設(shè)備與試劑

S#菌株斜面種子、天門冬氨酸、大米粉（80目）、酵母粉、玉米粉、黃豆粉（60目）、花生粉（60目）、氨基酸粉（60目）、棉籽粉（60目）、蠶蛹粉（60目）、磷酸氫二鉀（工業(yè)級）、氯化鈉（工業(yè)級）、氫氧化鈉（工業(yè)級）、消泡劑（工業(yè)級）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（SPH-2110）、三角瓶（500 mL）、種子罐（1000 L）、發(fā)酵罐（1000 L）、生物顯微鏡、酸度計、液相色譜儀。

1.2 種子配方優(yōu)化

1.2.1 種子試驗配方

以搖瓶試驗方式篩選最佳種子配方[4]，以生產(chǎn)配方為基礎(chǔ)，以大米為主碳源，探究玉米粉對發(fā)酵的影響，同時，探究氮源種類、配比不同的種子培養(yǎng)基配方對發(fā)酵水平的影響，采用正交試驗，各組種子培養(yǎng)基按表1配制。

搖瓶發(fā)酵配方：米粉8.00 %，酵母粉0.50%，黃豆粉1.50%，花生粉1.50%，棉籽粉0.50%，氯化鈉0.20%，磷酸氫二鉀0.02%。 1.2.2 試驗步驟

按上述配方中的原料種類和比例配制培養(yǎng)基，用20.00%氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至7.5，分裝至500 mL三角瓶中，裝量為60 mL，用棉塞加牛皮紙進行環(huán)繞式封口，立即用滅菌鍋高溫（120 ℃）消毒30 min，自然冷卻備用。在無菌條件下，將50 mL無菌水倒入S#菌株斜面種子瓶中，用竹簽刮下菌落搗碎搖勻后，用無菌移液管，對種子瓶進行接種，每個種子瓶的接種量為5 mL，用8層紗布封口，放至SPH-2110恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為240 r/min，37℃ 培養(yǎng)20～30 h，跟蹤菌絲掛壁狀態(tài)，鏡檢菌體生長的形態(tài)，判斷種子成熟時機。種子成熟后迅速接入預(yù)先準備好的無菌發(fā)酵搖瓶，接種量為5.00%，用8層紗布封口，每組2個放至 SPH-2110恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為240 r/min，40℃培養(yǎng)92 h后取濾液，用液相色譜儀檢測井岡霉素A組分含量。

1.3 發(fā)酵配方優(yōu)化

考慮搖瓶試驗條件與大生產(chǎn)條件存在一定的差異，中試罐的發(fā)酵條件與大生產(chǎn)發(fā)酵罐的條件更加接近，所以將發(fā)酵配方優(yōu)化試驗放在中試罐上進行[5]。以大生產(chǎn)配方為基礎(chǔ)，探究主要碳源大米粉配比不同和氮源種類不同、配比不同對發(fā)酵水平的影響，采用正交試驗，發(fā)酵培養(yǎng)基按表2配制。

1.3.1 發(fā)酵試驗配方

從搖瓶種子配方的試驗結(jié)果中選取最佳配方作為發(fā)酵配方中試試驗的種子罐配方（見表2）。其他統(tǒng)一按氯化鈉0.20%、磷酸氫二鉀0.02%、消泡劑0.03%配比。

1.3.2 試驗步驟

每批投料前對種子罐、發(fā)酵罐及各個閥門進行清潔和檢查，防止染菌。種子罐按400 L計料、350 L定容，發(fā)酵罐按6000 L計料、5 000 L定容，先投碳、氮源， pH調(diào)到7.5，投入無機鹽消泡劑，123 ℃蒸汽滅菌30 min，冷卻至培養(yǎng)溫度，每個種子罐接入1個斜面種子瓶。種子罐培養(yǎng)條件：37 ℃恒溫，通氣量為1.0∶1.0，攪拌轉(zhuǎn)速為240 r/min，培養(yǎng)時間為20～30 h，種子罐移種前要鏡檢，確保沒有雜菌，種子生長成熟才可以移入發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，移種量控制在5.00%。發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：40℃恒溫，通氣量為1.0∶1.2，攪拌轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)80 h后取濾液，用液相色譜儀檢測井岡霉素A組分含量。

2 結(jié)果討論

2.1 種子培養(yǎng)基配方對發(fā)酵水平的影響

影響發(fā)酵水平的因素除了發(fā)酵過程控制外，最重要的是種子質(zhì)量的控制。在種子培養(yǎng)過程中，中間控制環(huán)節(jié)往往相對簡單，影響最大的還是培養(yǎng)基原料的選擇。種子培養(yǎng)基原料的選擇一般首先要求原料質(zhì)量穩(wěn)定，既有利于菌絲的快速生長，又要保證每批種子生長穩(wěn)定、產(chǎn)素能力高，確保移入大罐后穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)。按表1試驗方案得到試驗結(jié)果如表3所示。

從表3的試驗數(shù)據(jù)得出，用搖瓶試驗篩選最佳種子配方。 A2種子配方：大米粉3.00%，花生粉2.00%，酵母粉0.50%，蠶蛹粉0.50%。在相同的培養(yǎng)條件下，種子生長較其他配方快2～4 h，發(fā)酵效價提高3.58%～20.16%，較實際大生產(chǎn)配方提高3.58%，為最佳配方。另外，碳源用大米粉較玉米粉生長更快，發(fā)酵效價提高13.55%;氮源用花生粉優(yōu)于黃豆粉，蠶蛹粉雖然用量不大，但明顯有利于提高發(fā)酵效價。? 2.2發(fā)酵培養(yǎng)基配方對效價的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基原料的選擇不僅要考慮生產(chǎn)水平的高低、原料的單位消耗、能耗、原料的易得程度和加工難度，還要考慮對后道提取的影響和產(chǎn)品的質(zhì)量，但最核心的還是綜合經(jīng)濟效益。發(fā)酵培養(yǎng)基配方中試優(yōu)化試驗在種子配方優(yōu)化后得出結(jié)論，選擇A2種子配方按表2的試驗方案進行，試驗檢測結(jié)果如表4所示。

從表4的試驗數(shù)據(jù)可知，在A 2種子配方條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基B8配方（大米粉10.00%，花生粉1.00%，棉籽粉1.00%，黃豆粉1.00%，酵母粉0.50%，蠶蛹粉1.00%）的發(fā)酵效價最高，比其他試驗配方高2.43%～12.75%，較大生產(chǎn)配方提高12.75%。另外，碳源用大米粉從8.00%提高到10.00%，發(fā)酵效價平均提高7.75%，效果明顯;在大米粉配比相同的情況下，配方中含蠶蛹粉的發(fā)酵效價較高。

3 結(jié)語

通過對井岡霉素種子配方的搖瓶優(yōu)化正交試驗、發(fā)酵配方中試優(yōu)化試驗，篩選到的A2種子配方和B8發(fā)酵配方效價比實際大生產(chǎn)配方分別提高了3.58%和13.55%，如果能在大生產(chǎn)中推廣并達到中試效果，預(yù)計至少能為企業(yè)增效500萬元。

[參考文獻]

[1]徐利劍，趙維，曹聰，等.井岡霉素的研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2015（22）：191-198.

[2]謝麗媛，尹文兵，李偉，等.白僵菌天然產(chǎn)物及其藥理活性和生物合成研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2021（1）：150-164.

[3]沈寅初.井岡霉素開發(fā)研究25年[J].植物保護，1996（4）：44-45.

[4]郭文燦，鐘世華，黃葉菊.井岡霉素生產(chǎn)工藝優(yōu)化研究[J].精細化工中間體，2006（2）：3.

[5]王蘋，吳佳文，張海波，等.我國防治小麥赤霉病的藥劑種類評析[J].中國植保導(dǎo)刊，2021（1）：7.