亞抑制濃度慶大霉素通過抑制ATP的產(chǎn)生降低大腸桿菌叢動(dòng)能力的機(jī)制

祝曉娟 龍永珍 陳曉玲 張瑩 彭青 周樹勤，4

1喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院麻醉科（新疆喀什844000）；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所（廣州510280）；3廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院兒科（廣州510220）；4南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科（廣州510280）

大腸桿菌是引發(fā)臨床感染最為常見的致病菌之一［1］。運(yùn)動(dòng)性是大腸桿菌致病力或侵襲力的表型之一，大腸桿菌運(yùn)動(dòng)性對(duì)細(xì)菌向宿主細(xì)胞移動(dòng)很重要［2-3］。運(yùn)動(dòng)性與大腸桿菌的遷移、擴(kuò)散、定植及免疫逃逸均有關(guān)［4-5］。有研究表明運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的大腸桿菌在自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎中比其他菌株致病力更強(qiáng)［6］。

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)方式主要包括叢動(dòng)（swarming）、游動(dòng)（swimming）及蹭行（twiching）［7］。游動(dòng)是指水環(huán)境下細(xì)菌細(xì)胞的個(gè)體無規(guī)則游動(dòng)，是鞭毛介導(dǎo)的直線游動(dòng)和翻騰運(yùn)動(dòng)交替進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)形式［7］。叢動(dòng)是在半固體培養(yǎng)基表面細(xì)菌群體由接種點(diǎn)向周圍擴(kuò)散的運(yùn)動(dòng)。叢動(dòng)和游動(dòng)這兩種運(yùn)動(dòng)都有鞭毛介導(dǎo)；但它們的區(qū)別在于：（1）叢動(dòng)是細(xì)菌群體性運(yùn)動(dòng)，而游動(dòng)是細(xì)胞個(gè)體行為；（2）叢動(dòng)的細(xì)胞會(huì)在代謝、形態(tài)及某些蛋白表達(dá)等方面發(fā)生顯著分化，即表面誘導(dǎo)分化現(xiàn)象，如鞭毛密度增加、菌體增長(zhǎng)，毒力蛋白分泌增加等特性變化［8-9］。蹭行是指某些細(xì)菌依靠Ⅳ型菌毛驅(qū)動(dòng)的顫抖現(xiàn)象［10］。

筆者前期研 究 發(fā) 現(xiàn)：1∕2～1∕8 最低抑菌 濃 度（MIC）的氨基糖苷類藥物慶大霉素預(yù)處理大腸桿菌ATCC25922 1 h 后，大腸桿菌的叢動(dòng)性顯著降低。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，參與三羧酸循環(huán)（TCA）的8 個(gè)基因表達(dá)均下調(diào)［11］。由于TCA 循環(huán)提供細(xì)菌生命活動(dòng)所需的能量（ATP），細(xì)菌叢動(dòng)性受細(xì)菌能量供應(yīng)的調(diào)控［9，12］。慶大霉素抑制叢動(dòng)與ATP 產(chǎn)生減少、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)所需能量不足的關(guān)系尚未明確。本研究將首先驗(yàn)證亞抑制濃度慶大霉素對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用，以及慶大霉素對(duì)TCA 相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響，測(cè)定ATP 水平，進(jìn)而觀察補(bǔ)充ATP 后是否能夠逆轉(zhuǎn)慶大霉素對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用。本研究在一定程度上闡明了亞抑制濃度的慶大霉素抑制大腸桿菌叢動(dòng)性的分子作用機(jī)制，可為慶大霉素在臨床治療大腸桿菌相關(guān)感染提供更多的理論基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑 大腸桿菌ATCC25922，MH肉湯（Muller-Hinton Broth，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）；MH 瓊脂（上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）；慶大霉素（上海生物工程有限公司）；牛肉粉、瓊脂、胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司，葡萄糖、氯化鈉、腺苷-5-三磷酸二鈉鹽（ATP）購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 慶大霉素預(yù)處理對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用 配制叢動(dòng)瓊脂培養(yǎng)板，使瓊脂培養(yǎng)基中含胰蛋白胨0.8%，酵母提取物0.4%，氯化鈉0.8%，瓊脂0.5%，葡萄糖0.5%。121 ℃高壓滅菌20 min，待其冷卻至50 ℃左右，倒入已滅菌的干燥平板中，冷卻備用。在MH 平板上挑取單克隆大腸桿菌過夜培養(yǎng)，用新鮮MH 肉湯稀釋菌液OD600至0.3，加入慶大霉素至終濃度為1∕2 最低抑菌濃度（MIC），該組細(xì)菌作為處理組，不加慶大霉素的菌液作為對(duì)照組，置于37 ℃孵育1 h。各取1 mL菌液轉(zhuǎn)移到2 mL EP 管中，室溫10 000 r∕min 離心3 min，去上清，用MH 肉湯洗滌3 次并重懸，用紫外分光光度儀測(cè)定OD600，稀釋菌懸液至OD600為0.2。處理組和對(duì)照組稀釋菌懸液各取2 μL 接種于叢動(dòng)瓊脂平板，在37 ℃下孵育12 h，觀察結(jié)果并測(cè)量直徑，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2 Real-time PCR 測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)水平 參考文獻(xiàn)見表1，設(shè)計(jì)合成目的基因丙酮酸脫氫酶輔酶編碼基因poxB 和aceE，Ⅱ型檸檬酸合成酶基因gltA，琥珀酸脫氫酶亞基編碼基因sdhD 和sdhC，蘋果酸輔酶A 連接酶beta 亞基編碼基因sucC，延胡索酸水合酶Ⅰ級(jí)編碼基因fumA，異檸檬酸脫氫酶編碼基因icd 及管家基因GAPDH 的引物。取1∕2MIC 的慶大霉素誘導(dǎo)后的菌液1.5 mL，先加2 倍體積的細(xì)菌RNA 保護(hù)液（RNA Protect Bacteria Reagent，Qiagen）混勻，室溫靜置5 min 后，離心，去上清，獲得菌體沉淀。按RNeasy Mini Kit 說明書提取細(xì)菌RNA，Nanodrop 測(cè)定RNA 濃度。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（RR047A，Takara）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA 模板，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（RR820A，Takara），EcoTMRealTime PCR system 進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用ΔΔCt 相對(duì)定量法分析目的基因在慶大霉素處理組及對(duì)照組的表達(dá)變化情況。

表1 Real-time PCR 的引物序列Tab.1 Primer sequence of Real-time PCR

1.2.3 細(xì)菌胞內(nèi)ATP 水平測(cè)定 采用ATP 檢測(cè)試劑盒ATP Detection Assay Kit-luminescence（Cayman chemical）測(cè)定慶大霉素對(duì)細(xì)菌ATP 產(chǎn)生的影響，過夜培養(yǎng)的細(xì)菌用新鮮MH 肉湯稀釋菌液OD600至0.5，加入慶大霉素至終濃度為1∕2 MIC 濃度，設(shè)置為處理組，不加慶大霉素的菌液作為對(duì)照組，37 ℃孵育1 h 后，將菌液取出，離心，冰浴條件下超聲破碎細(xì)菌3 min，每次超聲3 s 間隔3 s；12 000×g離心15 min，取上清放4 ℃?zhèn)溆谩０丛噭┖姓f明書配置制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀讀取慶大霉素處理組及對(duì)照組細(xì)菌裂解液的發(fā)光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本中的ATP 濃度，每組樣本測(cè)試3 次。

1.2.4 補(bǔ)充ATP 對(duì)慶大霉素預(yù)處理大腸桿菌叢動(dòng)性的逆轉(zhuǎn)作用 配置叢動(dòng)瓊脂培養(yǎng)板，瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min，待其冷卻至50 ℃左右，分別加入腺苷-5-三磷酸二鈉鹽（ATP）使其終濃度為0.9、2.7、4.5 mmol∕L，混勻后倒入已滅菌的干燥平板中，冷卻備用。大腸桿菌過夜培養(yǎng)菌液稀釋后，分別設(shè)置慶大霉素預(yù)處理和對(duì)照組，處理方法同前。處理結(jié)束后，各取1 mL 菌液轉(zhuǎn)移到2 mL EP管中，室溫10 000 r∕min離心3 min，去上清，用MH 肉湯洗滌3 次并重懸，用紫外分光光度儀測(cè)定OD600，稀釋菌懸液至OD600為0.2。處理組和對(duì)照組稀釋菌懸液各取2 μL 接種于叢動(dòng)瓊脂平板，在37 ℃下孵育12 h，觀察結(jié)果并測(cè)量直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism 5 軟件，t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慶大霉素對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用 大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)亞抑制濃度慶大霉素預(yù)處理后，細(xì)菌的叢動(dòng)性明顯減弱，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑為（25±2）mm，較對(duì)照組運(yùn)動(dòng)直徑（18.00 ± 2.00）mm 明顯減少（圖1）。該結(jié)果證實(shí)亞抑制濃度的慶大霉素可抑制大腸桿菌的叢動(dòng)能力。

圖1 亞抑制濃度慶大霉素對(duì)細(xì)菌叢動(dòng)性的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of subconcentration gentamicin on bacterial motility

2.2 亞抑制濃度慶大霉素下調(diào)大腸桿菌TCA相關(guān)基因表達(dá) Real-time PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，經(jīng)亞抑制濃度慶大霉素處理后，處理組大腸桿菌ATCC25922 的TCA 相關(guān)基因，poxB、aceE、gltA、sdhD、sdhC、sucC、fumA 及icd 基因表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)在0.35 ～0.60之間（圖2）。

圖2 Real-time PCR 檢測(cè)大腸桿菌ATCC25922 的TCA 相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.2 Real time PCR was used to detect the expression level of TCA related genes in Escherichia coli ATCC25922

2.3 亞抑制濃度的慶大霉素抑制細(xì)菌ATP 的產(chǎn)生 結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度為（24.2±3.45）fm，而1∕2MIC 慶大霉素處理的細(xì)菌胞內(nèi)ATP水平下降至（11.5 ± 1.98）fm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示亞抑制濃度慶大霉素對(duì)大腸桿菌ATP 合成具有抑制作用。

2.4 補(bǔ)充ATP 可逆轉(zhuǎn)慶大霉素對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用 在培養(yǎng)板添加0.9、2.7、4.5 mmol∕L ATP后，細(xì)菌被慶大霉素抑制的叢動(dòng)能力可被顯著逆轉(zhuǎn)，細(xì)菌在所有添加ATP 的平板中，叢動(dòng)能力均較對(duì)照組和預(yù)處理慶大霉素抑制組顯著增強(qiáng)（圖3）。但對(duì)比不同組間的運(yùn)動(dòng)直徑，結(jié)果顯示，在被慶大霉素預(yù)處理后，大腸桿菌在含0.9、2.7 mmol∕L ATP平板中的叢動(dòng)能力無差異，而隨著ATP 濃度增加至4.5 mmol∕L，細(xì)菌叢動(dòng)性并沒有繼續(xù)增強(qiáng)，反而有所下降，提示胞外環(huán)境中過量的ATP 有可能會(huì)抑制大腸桿菌的叢動(dòng)性。見表2。

圖3 補(bǔ)充ATP 逆轉(zhuǎn)慶大霉素對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用Fig.3 ATP supplementation reverses the inhibitory effect of gentamicin on the plexus of Escherichia coli

表2 不同處理組的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑測(cè)量結(jié)果Tab.2 Measurement results of bacterial movement diameter in different treatment groups ±s

表2 不同處理組的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑測(cè)量結(jié)果Tab.2 Measurement results of bacterial movement diameter in different treatment groups ±s

組別對(duì)照組（未經(jīng)處理）慶大霉素預(yù)處理+不含APT 平板慶大霉素預(yù)處理+0.9 mmol∕L ATP 平板慶大霉素預(yù)處理+2.7 mmol∕L ATP 平板慶大霉素預(yù)處理+4.5 mmol∕L ATP 平板細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑（mm）23.00±1.00 15.00±2.00 47.00±2.00 47.67±2.51 37.67±1.53

3 討論

慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素［15］。慶大霉素雖然有其毒副作用，但作為對(duì)革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌效果較好的抗生素之一，且具有較好的抗生素后效應(yīng)（PAE），因此臨床應(yīng)用仍然較廣［16-17］。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同亞抑制濃度（1∕8 ～1∕2 MIC）慶大霉素預(yù)處理1 h 后，撤去慶大霉素后，大腸桿菌的叢動(dòng)性仍然受到一定的抑制，且抑制作用隨著慶大霉素預(yù)處理濃度增加而增加，這一效應(yīng)也應(yīng)屬于慶大霉素的PAE 效應(yīng)的一種，這種特殊的PAE 作用對(duì)于臨床治療大腸桿菌感染具有其自身優(yōu)勢(shì)。Real-time PCR 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1∕2 MIC 慶大霉素處理后，大腸桿菌ATCC 25923 的TCA 相關(guān)基因，包括丙酮酸脫氫酶輔酶編碼基因poxB 和aceE、Ⅱ型檸檬酸合成酶基因gltA、琥珀酸脫氫酶亞基編碼基因sdhD 和sdhC、蘋果酸輔酶A連接酶beta 亞基編碼基因sucC、延胡索酸水合酶Ⅰ級(jí)編碼基因fumA 以及異檸檬酸脫氫酶編碼基因icd 均下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌琥珀酸脫氫酶亞基編碼基因sdhA、sdhB 及sdhC 突變株的叢動(dòng)性較野生株明顯降低，但其更深入的分子機(jī)制仍不清楚［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌經(jīng)亞抑制濃度的慶大霉素處理后，ATP 產(chǎn)生明顯降低。細(xì)菌叢動(dòng)性是一種群體性的運(yùn)動(dòng)，該行為需要細(xì)菌能量的供應(yīng)［19］，有研究發(fā)現(xiàn)，從基因表達(dá)譜的特點(diǎn)來看，細(xì)菌發(fā)生叢動(dòng)時(shí)存在異質(zhì)性，位于細(xì)菌叢動(dòng)中心的細(xì)菌更像提供營(yíng)養(yǎng)的菌群，而位于邊緣位置的細(xì)胞更傾向于表達(dá)參與能量代謝的基因，包括電子傳遞鏈的成分和ATP 的產(chǎn)生［20-21］。說明細(xì)菌叢動(dòng)性的運(yùn)動(dòng)方式跟能量代謝息息相關(guān)。據(jù)此，結(jié)合本研究結(jié)果，亞抑制濃度的慶大霉素對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用，可能與其抑制TCA 和進(jìn)一步抑制ATP 產(chǎn)生有關(guān)。

研究表明，在培養(yǎng)環(huán)境中補(bǔ)充ATP，細(xì)菌是可以將胞外的ATP 攝入到細(xì)菌內(nèi)部并進(jìn)行充分利用的［13］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ATP 產(chǎn)生減少是否是導(dǎo)致大腸桿菌叢動(dòng)性降低的原因，在叢動(dòng)培養(yǎng)基中添加了不同濃度的ATP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)慶大霉素預(yù)處理后，再接種于含不同濃度ATP叢動(dòng)培養(yǎng)基的大腸桿菌，其叢動(dòng)性均較對(duì)照組和慶大霉素預(yù)處理組的叢動(dòng)性明顯增強(qiáng)，提示亞抑制濃度慶大霉素是通過抑制ATP 的產(chǎn)生調(diào)控大腸桿菌的叢動(dòng)能力。但不同ATP 濃度組間存在結(jié)果差異，大腸桿菌在含0.9、2.7 mol∕L ATP 平板中的運(yùn)動(dòng)直徑相似，而隨著ATP 濃度增加至4.5 mol∕L，細(xì)菌叢動(dòng)性并沒有繼續(xù)增強(qiáng)，反而較前兩組有所下降，提示胞外環(huán)境中過量的ATP反而會(huì)抑制大腸桿菌的叢動(dòng)性。

本研究探討了亞抑制濃度的慶大霉素對(duì)大腸桿菌叢動(dòng)性的抑制作用相關(guān)機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞抑制濃度的慶大霉素可能通過抑制TCA 相關(guān)基因的表達(dá)，限制了細(xì)菌ATP 的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)菌叢動(dòng)性下降。該研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示慶大霉素的PAE 發(fā)生機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。