干細胞在顱骨缺損修補中的應用及研究進展

曹志威 邵國 趙志軍 張春陽

1內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院（內蒙古包頭014000）；2內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科（內蒙古包頭014000）；3包頭醫(yī)學院神經外科疾病研究所（轉化醫(yī)學）（內蒙古包頭014000）；4內蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復工程技術中心（內蒙古包頭014000）；5深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院轉化醫(yī)學中心（廣東深圳518172）

繼發(fā)于先天性疾病、創(chuàng)傷或顱腦手術所致的顱骨缺損是神經外科中常見且重要的臨床問題。由顱骨缺損引起的認知缺陷、記憶受損、運動障礙以及心理問題在患者中十分常見。關于顱骨缺損修補的研究在近年來取得了很大進展，修補策略包括來自患者自體骨、同種異體骨、異種骨和合成材料。移植材料對取材部位的額外損傷、需要二次手術以及有限可獲得性等抑制了自體骨移植的發(fā)展［1-2］；同種異體骨移植則受到嚴重失敗率、機械穩(wěn)定性差和免疫排斥等問題的阻礙［3-4］；而合成材料從鈦到羥基磷灰石，有機物質如膠原等，其可能具有優(yōu)異的機械性能，但它們與宿主骨整合和生長的能力是有限的。

在骨組織工程和再生領域，幾種干細胞已經用于治療顱骨缺損，干細胞成骨分化后移植已被證明是骨再生潛在可行的臨床策略，而移植干細胞促進顱骨修復和再生的機制仍存在較大爭議［5］。移植的細胞能否在體內長期存活并直接對修復做出貢獻，還是它們會在移植后死亡并通過旁分泌效應將細胞因子釋放到細胞外［6］，這是目前爭論的重點。本文就不同種類的干細胞在顱骨缺損修補中的應用以及該治療方法的發(fā)展前景進行綜述。

1 不同種類干細胞在顱骨缺損修補中的應用

1.1 骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 長期以來，自體BMSCs一直被認為是研究顱骨修補的理想干細胞來源。一些研究表明，在體外實驗中，它可以快速擴增分化為各種中胚層譜系，如脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞［7］，這些細胞有助于骨、軟骨、肌腱、脂肪、肌肉等間充質組織的再生。此外，BMSCs 也可以分化為外胚層型細胞，例如心肌細胞、內皮細胞（ECs）或平滑肌細胞（SMCs）等［8］。

小鼠BMSCs 已被證明可以修補同基因動物的顱骨缺損［9-11］。在修補過程中，需要合適的載體讓BMSCs 停留，首選具有生物相容性和可吸收性的支架構成的載體，其可限制組織排斥反應并允許缺損部位的骨生長。NAUDOT 等［9］利用三維靜電紡絲和打印技術制備了蜂窩狀聚已酸內酯（PCL）-納米羥基磷灰石（nHA）復合支架。在大鼠顱骨缺損模型中，該支架和BMSCs 的結合顯著改善了骨再生和骨礦化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)［12］，外泌體能夠促進BMSCs 的增殖、遷移和成骨分化，與純β-TCP支架相比，外泌體∕β-TCP 聯(lián)合支架可以有效促進顱骨缺損大鼠模型的骨修復和再生。然而，BMSCs 在臨床應用中存在一些實際缺陷，包括取材易造成患者痛苦、部位受損，并且隨著供體年齡的增加，其增殖和分化能力也會隨之降低。

如何改善BMSCs 取材方式，減輕其帶來的傷害是關注點之一。近年來，新興的研究表明，來源于干細胞的外泌體在干細胞旁分泌治療機制中發(fā)揮著重要作用，可能為未來無細胞治療提供一種全新的思路。

1.2 脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） ADSCs 是一種從脂肪組織中分離出來的基質細胞群，在形態(tài)和表型上與BMSCs 極其相似。ADSCs 同樣表現(xiàn)出向多系細胞分化的特征，如成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞和脂肪細胞［13］。ADSCs的提取相對容易，可以從皮下脂肪組織中直接獲得，與BMSCs 的獲取辦法相比，該方法成本更低，創(chuàng)傷更小，細胞產量更高，供體部位發(fā)病率更低。重要的是，與其他年齡相關的成人干細胞相比，ADSCs 的質量和增殖能力不會隨著患者的年齡而下降［14］。因此，作為臨床應用的來源，ADSCs 是一種優(yōu)于其他種類的成體干細胞。

多項研究表明，ADSCs 已成為顱骨缺損修補的可行選擇。WANG 等［15］將ADSCs 種植在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架上能夠促進大鼠顱骨缺損的修復，同時發(fā)現(xiàn)ADSCs 能夠分泌血管內皮生長因子（VEGF），VEGF 是血管生成的關鍵介質，而骨修復過程中需要血管形成，因此ADSCs 對骨形成有很大的促進作用。同樣，STUMBRAS等［16］利用富含生長因子的血漿（PRGF）與ADSCs 聯(lián)合應用治療兔顱骨缺損，結果顯示在骨愈合早期其增強了ADSCs 移植的再生潛能。

1.3 牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）從正畸或者臨床拔除的第三磨牙中獲得的牙髓干細胞具有分化為外胚層、內胚層和中胚層細胞的能力，并具有無限的自我更新能力［17］。GRONTHOS等［18］于2000年首次從成人第三磨牙中分離了人牙髓干細胞（HDPSCs），體外培養(yǎng)結果顯示，HDPSCs 與BMSCs 都具有發(fā)展為多細胞系的潛力，但HDPSCs在體外表現(xiàn)出比BMSCs 更高的增殖率。這可能是由于各個組織的發(fā)育狀態(tài)不同，因為第三顆磨牙是最后一顆完全發(fā)育和萌出的恒牙，與成人骨髓相比，處于較早的發(fā)育狀態(tài)。

LEE 等［19］將HDPSCs 和BMSCs 分別與可 吸收骨材料（Bio-Oss）相結合，植入兔顱骨缺損處，結果顯示，二者具有相似的骨密度、新骨形成和成骨相關蛋白表達，該體內實驗結果表明，移植在Bio-Oss上的DPSCs 與BMSCs 的骨再生效果相當。此外，近期有研究比較了DPSCs 和ADSCs 在體內外的成骨能力［20］，體外結果表明，DPSCs 具有更強的增殖和遷移能力，可表達更高的血管生成相關基因并分泌更多的血管內皮生長因子；ADSCs 能高表達成骨相關基因并有更多的礦物質沉積，展現(xiàn)出了更大的成骨分化潛能。在體內，ADSCs 組在移植后1 周就出現(xiàn)了明顯的新骨形成和礦化，而DPSCs 組在移植后3周才開始出現(xiàn)明顯的礦化過程。這些結果提示ADSCs可能比DPSCs更有利于骨再生。

DPSCs 作為一種未礦化的結締組織，在拔除和脫落的牙齒中很容易獲取。此外，它們還具有很強的增殖能力與免疫相容性，使其更好地與受體結合。近年來，因其巨大的分化潛能和非惡性表型，牙髓干細胞成為了再生醫(yī)學領域中臨床研究的熱點之一。然而，DPSCs 在顱骨缺損修補中的應用還需要進一步的研究。

1.4 人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cell，HAMSCs） HAMSCs 來 源 于胚外中胚層。它們顯示出三系分化潛能，表達與多能性相關的標記物，如干細胞特異性轉錄因子八聚體連接蛋白4（octamer-binding protein 4，Oct-4），并且表達能力比BMSCs 更強［21］。此外，有研究表明，與BMSCs 相比，二者的形態(tài)和多向分化潛能幾乎一致，但HAMSCs 擁有更強的增殖能力、免疫調節(jié)能力［22］和旁分泌特性［23］。

近幾年，HAMSCs 在顱骨缺損修補中有大量研究，JIANG 等［24］將HAMSCs 與骨填充材料相結合用于修補兔顱骨缺損，與對照組相比，未見明顯的移植反應，細胞能夠存活，影像學和組織學結果提示其促進了骨的形成，并加速了骨缺損中的骨礦化。同樣，在另一項研究中［25］，使用HAMSCs 與殼聚糖（Ch）-碳酸磷灰石（CA）支架相結合修補大鼠顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)移植8 周后，其血管內皮生長因子和成骨相關基因的表達明顯高于對照組。上述實驗提示HAMSCs 可能成為骨組織工程的一種候選種子細胞。

作為成體干細胞中的一種，HAMSCs 因其高活性、高純度、高增殖和低免疫原性而引起研究者的關注，但成骨能力似乎并沒有達到人們的預期，如何提高其成骨能力將是未來研究的重點。

2 提高干細胞治療效率的途徑

盡管以干細胞為基礎的治療方法是顱骨缺損修補中一種極具前景的手段，但此方法在人體內的療效仍不明確，不能廣泛應用于臨床，干細胞的植入率和存活率低是主要原因，這可能與顱骨缺損處惡劣的微環(huán)境有關。此外，干細胞的搭載材料也是影響治療效果的一個重要因素。盡管研究者們試圖通過應用各種材料來模擬自然骨支架，甚至將含有納米纖維的大通道支架與間充質干細胞結合［26］以修補顱骨缺損，但療效喜憂參半。為了克服這些問題，提高干細胞治療的效率，人們研究了許多不同的方法，現(xiàn)總結如下。

2.1 搭載細胞的仿生工程材料 自20 多年前骨組織工程的概念提出后，顱面骨再生技術得到了飛速發(fā)展。在顱骨損傷修補的過程中，可以定制仿生材料來調節(jié)細胞所處的微環(huán)境，這意味著人們能夠通過調整不同生物材料的成分、結構和特性來控制骨再生的速度。

這些生物材料通常由具有生物相容性和可吸收的支架組成，以限制組織排斥反應并為細胞附著、增殖、分化和新組織再生提供合適的環(huán)境［27］。這些支架分為無機和有機兩種，其中無機支架以磷酸鈣（CAP）生物陶瓷為代表，有機支架主要由天然或合成的生物聚合物形成，在這些有機支架聚合物中，人工合成的聚己內酯（PCL）是長期植入物和組織工程支架的極佳候選材料［28］。除此之外，支架的結構和孔隙大小也在促成骨過程中起著重要作用。近年來，電紡支架因其靈活性、易用性、成本效益、對齊結構和控制纖維直徑的能力而受到極大關注［29］。

目前，仿生工程材料的選擇已成為一個熱門領域，眾多研究者試圖規(guī)避各種材料的缺點，并探索新的特性材料來運用到支架制備中，這將是干細胞移植治療的新趨勢。

2.2 生長因子修飾 許多生長因子已被證明在顱骨生長發(fā)育過程中起關鍵作用，包括轉化生長因子-β（TGF-β）、成纖維細胞生長因子（FGF）、血管內皮生長因子（VEGF）和骨形態(tài)蛋白（BMPs）［30］。在體內，生長因子通過與不同的細胞外基質分子結合而受到保護。選擇合適的生物材料載體系統(tǒng)對單個或多個生長因子的局部和持續(xù)釋放一直被認為是至關重要的。

目前這些生長因子通常是通過化學或物理方式將其包埋在生物材料里。PATEL 等［31］將VEGF和BMP-2 輸送至大鼠顱骨缺損模型中，展示了完全的骨再生能力。此外，近期研究表明，對生長因子進行基因修飾后可以增強支架的功能，RAFTERY 等［32］將改良后的BMP-2 質粒植入膠原羥基磷灰石支架中，能夠顯著提高支架內搭載的間充質干細胞的成骨能力。

2.3 預處理干細胞 為了提高移植細胞的存活率及在體內的成骨能力，人們提出在移植前對干細胞進行預處理，以減少細胞凋亡，維持細胞在體內的生物學功能，并向特定方向分化。

目前大多數(shù)觀點主張，將干細胞在體外成骨誘導一段時間后與支架結合移植入體內，這樣做的目的在于能夠避免體內環(huán)境對細胞的影響并使其向成骨細胞特異性分化［33］。然而，一項研究的結果出乎意料，LI 等［34］認為未誘導的ADSCs 也可作為種子細胞用于構建骨組織工程，該實驗表明未誘導的ADSCs 與成骨誘導的ADSCs 在新骨形成方面并無明顯差異，在體內也能成骨，這種結果或許與細胞狀態(tài)和材料選擇等有一定關系，不過預處理干細胞似乎更被認可。

2.4 多細胞聯(lián)合治療 為達到最佳修補效果，有人研究了不同種類的干細胞聯(lián)合治療顱骨缺損。JIANG 等［24］利 用HAMSCs 和HBMSCs 都具 有 成骨能力但又有不同方面的優(yōu)勢，使用Transwell 系統(tǒng)對二者進行共培養(yǎng)，結果表明二者共培養(yǎng)時，形成的礦化結節(jié)比單獨培養(yǎng)更加明顯，其成骨標志物的相對表達均顯著上調。這些數(shù)據(jù)說明二者能相互促進成骨，起到更好的治療效果。此外，另幾個研究小組的數(shù)據(jù)顯示，與單一種子細胞相比，ADSCs 與內皮祖細胞（EPCs）共培養(yǎng)可促進大鼠顱骨缺損的血管化骨再生［35］。與單純3D 打印羥基磷灰石∕凝膠納米（HAP-GEL）支架相比，通過BMSCs 和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與3D 打印HAP-GEL 支架材料共培養(yǎng)移植到缺損顱骨處，可增強骨修復能力［36］。

上述結果表明，不同種類干細胞的聯(lián)合培養(yǎng)提高修補效果是有希望的，細胞-細胞的互補和協(xié)同作用，將克服任何單一干細胞類型的不足。

3 總結與展望

顱骨缺損后修補材料及修補風險等問題一直是神經外科探討的焦點。在缺乏特異性靶向治療的情況下，目前顱骨缺損的治療主要依靠各種仿生材料進行修補?；诟杉毎膹秃现Ъ茉谠S多動物研究中已被證明具有顱骨修復的能力，基因工程、預處理和骨組織工程已被廣泛應用于提高干細胞治療的療效，多種干細胞的聯(lián)合應用可進一步提高干細胞治療的效果。此外，通過改變固有的生物材料特性以調節(jié)干細胞在宿主體內命運的創(chuàng)新方法，不僅對促進顱骨再生有重要意義，而且將消除使用生化誘導劑或可溶性因子帶來的副作用。綜上所述，目前國內外對干細胞治療的理解以及新興方法的發(fā)現(xiàn)能更好擴大干細胞治療顱骨缺損的臨床應用。