虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓生長過程的毒性影響評價

宋 潔， 韓家旋， 葉 智， 雷 研， 段琪月

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點實驗室， 陜西 西安 710021；2.西安長慶化工集團有限公司， 陜西 西安 710018)

0 引言

植物源提取物指采用適當?shù)娜軇┗蚍椒ǎ灾参餅樵咸崛』蚣庸ざ傻奈镔|(zhì)，可用于醫(yī)藥、食品、紡織、造紙等行業(yè)，作為添加劑和染料使用[1-3].與合成添加劑及染料不同，天然植物提取物大多源于自然界，故其來源廣泛、可再生、生物相容性好、易于降解，并且無毒無害[4-6].某些植物源：如我國的中草藥，還具有抗菌、消炎、防蟲、抗過敏等特殊功效[7-11].虎杖(Polygonumcuspidatum)即為其中的一種，其所含有的蒽醌類成分為水溶性提取物的代表，同時具有廣譜抗菌性[12-15].

可生物降解材料可以解決高分子合成材料帶來的環(huán)境污染問題，使用后能夠在堆肥、土壤、水或活化污泥等環(huán)境下被微生物或動植物體內(nèi)的酶最終分解為二氧化碳和水，對環(huán)境友好.因此將植物源提取物與可生物降解材料共混，能夠在對高分子材料著色的同時賦予其染色和抗菌功能性效果[16-19].但目前在材料復(fù)合及降解過程中，提取物中的成分是否發(fā)生變化，是否會產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)而對環(huán)境產(chǎn)生影響，對于該類復(fù)合材料對環(huán)境的影響評價尚未有定論.

利用動物的生長狀況診斷土壤污染程度是間接判斷環(huán)境污染情況的重要方法之一，蚯蚓即為其中的一種[20-22].本研究就是將天然虎杖提取物與可生物降解材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)復(fù)合，制備虎杖提取物/PBS復(fù)合材料.評價復(fù)合材料在降解過程中，對蚯蚓生長過程中蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量、過氧化氫酶(CAT)和纖維素酶活性的影響，為虎杖提取物/PBS復(fù)合材料的生態(tài)環(huán)境安全評價提供理論及數(shù)據(jù)支持，完善虎杖提取物/PBS復(fù)合材料的環(huán)境評價體系，為其產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)奠定基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 主要原料

PBS：日本理學(xué)株式會社，Mn=1×104；天然虎杖(根部)：市售；無水乙醇：分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠.抗熱上海青605：市售；赤子愛勝蚓：市售；考馬斯亮藍G-250：溫州市東升化工試劑廠；磷酸：天津市富宇精細化工有限公司；牛血清蛋白(BSA)：國藥集團化學(xué)有限公司；磷酸二氫鈉：天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；磷酸氫二鈉:天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；碳酸鈣：天津市百世化工有限公司；丙酮：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸：上海山浦化工有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)：上海試劑二廠；愈創(chuàng)木酚：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；過氧化氫：上海卒瑞生物科技有限公司；Tris堿：科昊生物工程有限責(zé)任公司；鹽酸：北京化工廠；羧甲基纖維素鈉鹽：天津市福晨化學(xué)試劑廠；DNS指示劑：自制；葡萄糖：生興生物技術(shù)有限公司；NaOH：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 主要設(shè)備及儀器

SK-160開放式煉塑機：上海齊才液壓機械有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1D-50冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-2006A紫外可見分光光度計：尤尼柯(上海)儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機：上海標本模型廠；SPX-GB-250光照培養(yǎng)箱：上海博態(tài)實驗設(shè)備有限公司；高速粉碎機：河南豫龍重工業(yè)機器有限公司；傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀：VERTE-22型，德國 Bruker 公司；廣角 X 射線衍射 (WAXD) 儀：AD/Max-3c 型；接觸角測定儀：FM40MR2 Easydrop 型，德國KRUSS 公司.

1.3 虎杖提取物/PBS復(fù)合材料的制備

1.3.1 虎杖提取物的提取

將虎杖根部洗凈，干燥后粉碎.以95%乙醇為溶劑，料液質(zhì)量比1∶15，采用超聲波輔助提取法對虎杖粉末進行提取.超聲溫度40 ℃，超聲時間30 min，提取完畢后，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得到粉末狀虎杖提取物.

1.3.2 復(fù)合材料的制備

采用開放式煉塑機，調(diào)整輥子升溫至110 ℃后開啟滾筒，將PBS顆粒放入兩輥之間，完全熔融后將虎杖提取物按照質(zhì)量比1%、5%、9%分別加入PBS當中，待均勻混合后，混煉，制得虎杖提取物/PBS復(fù)合材料，冷卻后取下粉碎備用.

1.4 測試與表征

1.4.1 FTIR 表征

采用溴化鉀壓片法制備樣品，測試范圍 500～4 000 cm-1.

1.4.2 結(jié)晶性能測試

40 kV，40 mA，Cu靶，掃描速度為 6 °/min.

1.4.3 親疏水性

以蒸餾水在復(fù)合材料表面的接觸角(θ) 表示復(fù)合材料的親疏水性能，三次測量取平均值.

1.4.4 復(fù)合材料的降解性能

模擬自然降解測試：取陜西科技大學(xué)花園土，將其與水以質(zhì)量比1∶5混合攪拌24 h后，靜置24 h，取上層清液作為降解液.將不同比例復(fù)合材料裁成25 mm×25 mm×0.6 mm的試樣，真空干燥后準確稱量，并放入盛有降解液的離心管，置于搖床中模擬自然降解過程，每6天取樣一次.取得試樣用蒸餾水反復(fù)沖洗，干燥至恒重后稱量，計算降解后試樣的質(zhì)量損失率.每組3個平行，取平均值.其降解率的計算公式為：

(1)

式(1)中：m為試樣的質(zhì)量損失率(%)；m0為試樣的原始質(zhì)量(g)；m1為降解后試樣的質(zhì)量(g).

GPC測試：采用大連依利特分析儀器有限公司EC2006凝膠滲透色譜儀來測定數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和分散系數(shù)，CHCl3作為流動相，流速為1 mL·min-1，試樣濃度是1～3 mg·mL-1，注入量為15μL，溫度40 ℃，標準樣為PS.

1.5 蚯蚓生長環(huán)境評價

1.5.1 蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究

研究物質(zhì)對土壤生態(tài)環(huán)境毒性的一種常用方法是用蚯蚓進行實驗.這是因為蚯蚓是一些高等動物的食物來源，并在環(huán)境中扮演著橋梁的作用.所以它常被作為評價物質(zhì)對生態(tài)環(huán)境毒性大小的首選指示動物，關(guān)于實驗研究方法有很多種，而關(guān)于研究小分支物質(zhì)及有機污染物的方法主要有自然土壤急性毒性實驗和自然土壤慢性毒性實驗.

1.5.2 自然土壤急性實驗

自然土壤急性實驗是指在14 d內(nèi)，將污染物與蚯蚓直接接觸，在實驗室條件下培養(yǎng)，并取樣觀察齊生理變化.

(1)自然土壤染毒

取陜西科技大學(xué)校園土風(fēng)干.用500 mL燒杯做容器每只燒杯(500 mL)200 g土樣.分別將以土壤量的2.2%加入粉碎后不同比例的虎杖提取物/PBS復(fù)合材料，或與不同比例復(fù)合材料中提取物含量一致的虎杖提取物混合均勻標記.每只燒杯加40 mL純凈水.每個比例設(shè)置三個平行樣.

(2)蚯蚓清腸

取2 L燒杯，在底部鋪上兩層濾紙，加少量蒸餾水浸沒濾紙.將購買的蚯蚓用溫度約30 ℃的溫水清理放入燒杯，將燒杯封口并用解刨針扎孔.將燒杯放入相對濕度70%的光照培養(yǎng)箱中白光條件20 ℃清腸12 h，蚯蚓清腸后如圖1所示.

圖1 已清腸蚯蚓的狀態(tài)

(3)培養(yǎng)

將清腸后的蚯蚓洗凈擦干稱重，置于土壤中，每個燒杯內(nèi)放10條長、體質(zhì)量基本相同的蚯蚓，并設(shè)置CK(不添加提取物和PBS)、PBS(只添加PBS，含量為土壤量的2.2%)的兩組對照.將容器封口并扎孔，以保持濕度和空氣的通透性.將裝有蚯蚓的燒杯放入光照培養(yǎng)箱中，恒溫20±2 ℃，相對濕度75%，光照時間比12 h∶12 h交替培養(yǎng).分別于7 d、14 d取樣測定蛋白質(zhì)含量、過氧化氫酶(CAT)和纖維素酶活性.每隔兩天加適量的水補充蒸發(fā)，在整個實驗周期內(nèi)未見蚯蚓死亡.

1.5.3 自然土壤慢性實驗

自然土壤慢性實驗是指研究蚯蚓在與供試物接觸后從14 d起添加相關(guān)物質(zhì)供蚯蚓生存，并每隔一段時間測試蚯蚓的相關(guān)生理指標.

(1)、(2)與1.5.2自然土壤急性實驗中(1)、(2)相同.

(3)培養(yǎng)

從培養(yǎng)第二周開始，每周在土壤表面添加一次磨細的干牛糞，并噴灑適量水分使牛糞濕潤.添加標準為每條蚯蚓0.5 g牛糞.分別于在21 d、28 d取樣測定蛋白質(zhì)含量、過氧化氫酶(CAT)和纖維素酶活性.每隔兩天加適量的水補充蒸發(fā)，在整個實驗周期內(nèi)未見蚯蚓死亡.

1.5.4 蚯蚓生理指標研究

經(jīng)過大量實驗表明，蚯蚓體內(nèi)的酶活常被用做環(huán)境污染程度的生物指示物，其相關(guān)的生理指標有很多，但研究最多有蛋白質(zhì)、纖維素活性、抗氧化物酶，其對蚯蚓的影響如下：

(1)蛋白質(zhì)

蚯蚓體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量約為50%～65%，包括十幾種氨基酸和溶解酶.而正是由于這些溶解酶在一定條件下會發(fā)生溶解，所以將引起土壤環(huán)境的改變，如pH和濕度的改變，其溶解酶也會發(fā)生相應(yīng)的變化，從而影響蚯蚓的生長.

(2)纖維素酶

蚯蚓在進食時，會攝取一些纖維素物質(zhì)，而纖維素物質(zhì)進入體內(nèi)后，需要更多的纖維素酶消化纖維素物質(zhì)，因此纖維素酶活的變化也可以用來指示蚯蚓受污染物的影響.

(3)抗氧化物酶

抗氧化物酶包括過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶.當蚯蚓受到外來刺激時，其體內(nèi)的H2O2和O2·-會增加，因此會導(dǎo)致機體發(fā)生病變，這種解毒酶能夠?qū)⑵浞纸庑纬蒆2O和O2，從而減輕毒性維持機體氧化和抗氧化平衡，避免機體受到損害.因此通過CAT活性變化，可以有效判斷污染物對蚯蚓作用的大小，同時間接反應(yīng)污染物對環(huán)境的有害程度.

1.5.5 蚯蚓各項生理指標的測定方法

(1)蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的測定

將蚯蚓與pH 7.6的Tris-HCl緩沖液制備成1∶10(w/v)的組織勻漿，在高速冷凍離心機9 000 r/min轉(zhuǎn)速下4 ℃離心15 min，取組織勻漿上清液與生理鹽水按1∶4(v/v)稀釋成20%的提取液.量取蚯蚓提取物溶液1.0 mL，加入考馬斯亮藍工作液5 mL混勻室溫放置5 min，于595 nm處比色.

考馬斯亮藍試液配置方法：稱取考馬斯亮藍G-250 100 mg，溶解在50 mL 95%乙醇里，加入85%磷酸100 mL，加水定容至200 mL，4 ℃保持穩(wěn)定.

蛋白質(zhì)標準曲線的繪制：稱量100 mg牛血清蛋白(BSA)，將其溶解于水中，定容至100 mL，得到1 mg·mL-1的BSA標準樣.按表1中的順序依次給試管編號，依照下表配置每管溶液，并向每個試管中加入5 mL考馬斯亮藍試液，混勻后，常溫靜置5 min，595 nm下測其吸光度.以蛋白質(zhì)含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，得牛血清蛋白的標準曲線為：y=0.006 3x-0.006 1，R2=0.994 4.

表1 蛋白質(zhì)含量標準曲線

(2)蚯蚓中過氧化氫酶(CAT)活性的測定

取蛋白質(zhì)檢測實驗中的提取液，按照表2的方法加入試劑，配制完成后，立即開啟秒表，測定240 nm處的吸光度值，每隔一分鐘讀取一次，計算CAT活性.

(2)

式(2)中：ΔA240為吸光度差；t為加H2O2到最后一次讀數(shù)的時間(min)；V1：提取液總體積(mL；V2測定用提取液體積(mL)；W：為蚯蚓重量(g).

表2 過氧化氫酶(CAT)活性的測定

(3)蚯蚓中纖維素酶活性的測定

底物溶液：邊加熱邊將0.625 g羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)溶于100 mL水中用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.4.

葡萄糖標準曲線的繪制：稱取無水葡萄糖250.00 mg，溶于蒸餾水中，定容至250 mL，配制成0.1%葡萄糖標準溶液.分別吸取2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL 0.1%葡萄糖標準溶液，定容至50 mL，再分別吸取上述溶液2.5 mL于試管中，各加2.5 mL DNS指示液，煮沸5 min(另作1管對照，取2.5 mL蒸餾水，加入2.5 mL DNS指示劑，同樣煮沸5 min).冷卻后，用分光光度計在520 nm波長下比色，以葡萄糖的含量為橫坐標，以A520nm 為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線如表3所示.所得曲線回歸方程為：y=0.859 4x-0.004，R2=0.999 6.

表3 葡萄糖標準曲線

纖維素酶活測定方法：取蛋白質(zhì)檢測實驗中的提取液，以3 000 r·min-1進行第二次離心，其上清液即為纖維素酶的待測液.采用羧甲基纖維素法，取1 mL待測液，再往試管中加入4 mL底物溶液，40 ℃水浴5 min后，加入1 mL 1mol· L-1的NaOH溶液和3 mLDNS指示劑使反應(yīng)終止.再將試管于沸水中加熱5 min，冷卻后用蒸餾水定容到25 mL搖勻，520 nm處測定其吸光度，計算纖維素酶活性.對照組的配制為加入等量的NaOH溶液和DNS指示劑后再加入1 mL待測液.

(3)

式(3)中：Ew為1 mL所用酶液中含有酶的重量(g).

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合材料的紅外光譜分析

圖2為純PBS和添加5%虎杖提取物/PBS復(fù)合材料的紅外光譜圖.從圖2中可以看出，虎杖提取物為5%的復(fù)合材料與純PBS相比，均出現(xiàn)了2 962 cm-1處甲基、亞甲基的伸縮振動吸收峰，1 714 cm-1處C=O的伸縮振動吸收峰，1 157 cm-1、1 045 cm-1處酯基中C-O的伸縮振動吸收峰，說明虎杖提取物的添加只是與PBS進行了共混，并沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng).由圖2還可以看出，添加虎杖提取物的復(fù)合材料中3 300 cm-1處-OH的伸縮振動吸收峰均較純PBS有所增強，再次印證了所添加虎杖提取物有效成分中均含有一定量的親水性基團-OH，導(dǎo)致復(fù)合后材料的-OH數(shù)量增多.同時，虎杖/PBS復(fù)合材料中C-O的伸縮振動吸收峰(1 024 cm-1)較純PBS(1 045 cm-1)向低波數(shù)產(chǎn)生了移動，說明虎杖提取物成分中的-OH可能作為給電子基與PBS發(fā)生了分子間作用.

圖2 虎杖提取物5%/PBS復(fù)合材料的FT-IR譜圖

2.2 虎杖提取物對復(fù)合材料結(jié)晶性的影響

圖3為虎杖提取物/PBS復(fù)合材料的X射線衍射分析.從圖3中可以看出，純PBS在020、021、110晶面顯示出三組較強的特征衍射峰、在111晶面顯示出一個較弱的特征衍射峰，而虎杖提取物/PBS復(fù)合材料與純PBS相比其衍射峰的出峰位置基本相似，說明虎杖提取物的添加對PBS的結(jié)晶形貌幾乎沒有影響.但與純PBS比較，隨著虎杖提取物比例不同，復(fù)合材料在相同晶面的衍射角2θ均向小角度方向產(chǎn)生了移動，說明虎杖提取物在該比例下可以促進復(fù)合材料的結(jié)晶，使得球晶晶粒尺寸減小、結(jié)晶度升高.

圖3 虎杖提取物/PBS復(fù)合材料的WAXD圖

2.3 虎杖提取物對復(fù)合材料親疏水性的影響

圖4為虎杖提取物1%、5%、9%/PBS復(fù)合材料的接觸角照片.從圖4中結(jié)晶性能研究可以看出，虎杖提取物對PBS起到了促進成核的作用，從而會使得復(fù)合材料的球晶排列增加緊密，不利于水分子深入，親水性應(yīng)該是下降的.但從圖4可以看出，當在PBS中加入虎杖提取物時，隨著其含量的不斷增大，復(fù)合材料的接觸角較PBS呈現(xiàn)更加親水性的狀態(tài)，且接觸角依次減小，再次驗證虎杖提取物有較強的的親水性，且其所產(chǎn)生的親水效應(yīng)大于結(jié)晶作用產(chǎn)生的疏水效應(yīng).

(a) PBS ( b)虎杖提取物1%/PBS復(fù)合材料 (c)虎杖提取物5%/PBS復(fù)合材料 (d)虎杖提取物9%/PBS復(fù)合材料圖4 虎杖提取物/PBS復(fù)合材料的接觸角

2.4 復(fù)合材料的降解性能

圖5為虎杖提取物/PBS復(fù)合材料降解60 d的質(zhì)量損失率.由圖5可以看出，降解前期復(fù)合材料的降解速率明顯要高于PBS，且隨著提取物含量的增加，復(fù)合材料的降解速率在0～12 d內(nèi)加速顯著，12～30 d趨于緩慢，30 d后有所上升，提取物含量為9%的復(fù)合材料其降解速率最顯著.說明當在PBS中加入提取物時，提取物作為小分子物質(zhì)，能夠首先作為碳源被微生物侵蝕，并在復(fù)合材料的內(nèi)部形成不均一的孔洞.當提取物含量不斷增加時，由于其本身的親水性，導(dǎo)致在酶解的同時，進一步加速了水分子的侵入，使其與微生物及水分子的接觸面積進一步增大.而析出的提取物小分子由于其具有較強的抗菌功效，使得其對降解環(huán)境產(chǎn)生的影響，因而在適應(yīng)期中降解速率平緩.當微生物種群適應(yīng)了降解環(huán)境后，復(fù)合材料的水解、酶解和提取物的降解仍協(xié)同產(chǎn)生，使得復(fù)合材料的降解速率持續(xù)增加.

表4為虎杖提取物/PBS復(fù)合材料降解前后的分子量及分散系數(shù).從表4可以看出，PBS及不同比例復(fù)合材料降解后數(shù)均分子量及重均分子量都有所降低，但復(fù)合材料的降低程度隨著提取物添加量的增加更加顯著.同時降解后，復(fù)合材料的分散系數(shù)隨著提取物添加量的增加較降解前呈現(xiàn)依次下降的趨勢，再次印證了復(fù)合材料在降解時先從小分子物質(zhì)開始降解，隨著降解時間的延長，降解得以促進，PBS的酶解產(chǎn)物和提取物的降解共同對土壤環(huán)境產(chǎn)生影響.

圖5 虎杖提取物/PBS復(fù)合材料降解60 d的質(zhì)量損失率

表4 虎杖提取物/PBS復(fù)合材料降解前后的分子量及分散系數(shù)

2.5 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響

蚯蚓體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量約為50%～65%，包括十幾種氨基酸和溶解酶.而正是由于這些溶解酶在一定條件下會發(fā)生溶解，所以將引起土壤環(huán)境的改變，從而影響蚯蚓的生長.圖6為虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響.表5虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響的數(shù)據(jù)及其誤差統(tǒng)計.

從圖6(a)可以看出：第7 d、第14 d時，虎杖提取物實驗組與CK對照組及PBS對照組相比，蚯蚓中蛋白質(zhì)的含量均大于CK對照組及PBS對照組，且隨著虎杖提取物濃度的增大對蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量影響越明顯.說明虎杖提取物對蚯蚓蛋白質(zhì)的合成有明顯的刺激作用，面對外來的刺激，蚯蚓會做出拮抗反應(yīng)，即蚯蚓的體壁組織和腸組織分泌的酶會增加.提取物含量越高對蚯蚓產(chǎn)生的拮抗作用越強，因而蛋白質(zhì)含量依次升高.在慢性毒性過程中，第21 d時，過量的PBS降解產(chǎn)物開始對蚯蚓中蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生抑制，第28 d，虎杖提取物在添加量較大時，其中的抗菌成分使得土壤環(huán)境改性，開始影響蚯蚓蛋白質(zhì)的合成，但影響小于PBS本身.

從圖6(b)可以看出：虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響與只添加虎杖提取物的趨勢基本相同，同樣是急性毒性實驗過程中，復(fù)合材料實驗組蚯蚓中蛋白質(zhì)的含量均大于CK對照組及PBS對照組，且隨著虎杖提取物濃度的增大對蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量影響與明顯.而第21 d、第28 d時，過量的PBS降解產(chǎn)物和降解的虎杖提取物同時開始對蚯蚓中蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生抑制，但在小比例添加時復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)的影響均高于CK對照組及PBS對照組.兩者對比，虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響趨勢要優(yōu)于虎杖提取物.

(a)虎杖提取物對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響

(b)虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響圖6 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響

表5 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中蛋白質(zhì)含量的影響

2.6 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中過氧化氫酶(CAT)活性的影響

過氧化氫酶(CAT)是種抗氧化物酶，當蚯蚓受到外來刺激時，其體內(nèi)的H2O2和O2·-會增加，因此會導(dǎo)致機體發(fā)生病變，這種解毒酶能夠?qū)⑵浞纸庑纬蒆2O和O2，從而減輕毒性維持機體氧化和抗氧化平衡，避免機體受到損害.因此通過CAT活性變化，可以有效判斷污染物對蚯蚓作用的大小，同時間接反應(yīng)污染物對環(huán)境的有害程度.圖7為虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中過氧化氫酶(CAT)活性的影響.表6為虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中過氧化氫酶活性的數(shù)據(jù)及其誤差統(tǒng)計.

從圖7(a)可以看出：第7 d、第14 d時，虎杖提取物實驗組與CK對照組及PBS對照組相比，蚯蚓中CAT的活性均大于CK對照組及PBS對照組，且隨著虎杖提取物濃度的增大對蚯蚓體內(nèi)CAT活性的影響越明顯，但濃度過大時在第7 d蚯蚓還不能較好的適應(yīng)外來抗菌效應(yīng)對土壤的影響，因而在虎杖提取物添加量為9%時CAT活性較添加量為5%時略有下降.說明虎杖提取物的添加能夠顯著誘導(dǎo)CAT的活性，使得CAT的合成增加.第21 d時，PBS發(fā)生水解和酶解共同產(chǎn)生的小分子物質(zhì)對蚯蚓中CAT的合成仍處于促進狀態(tài)，而第28 d時，過多的小分子物質(zhì)開始抑制CAT的活性.而虎杖提取物對蚯蚓中CAT活性的影響在整個慢性毒性過程中，均高于CK對照組及PBS對照組，且隨著復(fù)合材料中虎杖提取物含量的增加，其影響呈現(xiàn)依次升高的趨勢，再次說明虎杖提取物的添加能夠顯著增強CAT的活性.

從圖7(b)可以看出：虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中CAT活性的影響與虎杖提取物的趨勢基本相同，復(fù)合材料在降解協(xié)同作用下，在整個急性、慢性毒性過程中，對蚯蚓中CAT的影響仍高于CK對照組及PBS對照組，且隨著復(fù)合材料中虎杖提取物含量的增加，其影響呈現(xiàn)依次升高的趨勢，也說明虎杖提取物的添加增強了CAT的活性.同樣第21 d時，PBS發(fā)生水解和酶解共同產(chǎn)生的小分子物質(zhì)對蚯蚓中CAT的合成處于促進狀態(tài)，而第28 d時，過多的小分子物質(zhì)開始抑制CAT的活性.兩者對比，虎杖提取物對蚯蚓中CAT活性的影響趨勢要優(yōu)于虎杖提取物/PBS復(fù)合材料.

(a)不同比例虎杖提取物對蚯蚓中過氧化氫酶(CAT)活性的影響

(b)虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中過氧化氫酶(CAT)活性的影響圖7 不同比例虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中過氧化氫酶(CAT)活性的影響

表6 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中過氧化氫酶活性的影響

2.7 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中纖維素酶活性的影響

圖8為虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中纖維素酶活性的影響.表7為虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中纖維素酶活性的數(shù)據(jù)及其誤差統(tǒng)計纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中，它是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，可將蚯蚓攝入體內(nèi)的纖維素分解成寡糖或單糖.

從圖8(a)可以看出：第7 d時，蚯蚓對PBS水解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)及虎杖提取物給予的刺激處于適應(yīng)階段，除虎杖提取物9%實驗組外，其它實驗組對蚯蚓纖維素酶活性的影響均小于CK組.第14 d時，虎杖提取物實驗組蚯蚓中纖維素酶的活性均大于CK對照組及PBS對照組，且隨著虎杖提取物濃度的增大對蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性增大越明顯，說明虎杖提取物的添加能夠顯著促進纖維素酶的合成.在慢性毒性過程中，第21 d、第28 d時，PBS對照組蚯蚓中纖維素酶的活性大于CK對照組，同時虎杖提取物實驗組中纖維素酶的活性均大于CK對照組及PBS對照組，說明虎杖提取物對蚯蚓中纖維素酶的活性影響更顯著.

從圖8(b)可以看出：虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中纖維素酶活性的影響在第7 d時，復(fù)合材料對照組對蚯蚓中纖維素酶的活性影響均小于CK對照組及PBS對照組，但隨著提取物含量的增加，對纖維素酶的合成略有增加.第14 d時，復(fù)合材料實驗組蚯蚓中纖維素酶的活性均大于CK對照組及PBS對照組，且隨著虎杖提取物濃度的增大對蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性增大越明顯.在慢性毒性過程中，第21 d、第28 d時，同樣PBS對照組蚯蚓中纖維素酶的活性大于CK對照組，且虎杖提取物實驗組蚯蚓中纖維素酶的活性均大于CK對照組及PBS對照組，再次說明虎杖提取物能夠促進蚯蚓中纖維素酶的合成.兩者對比，虎杖提取物對蚯蚓中纖維素酶活性的影響趨勢要優(yōu)于虎杖提取物/PBS復(fù)合材料.

(a)虎杖提取物對蚯蚓中纖維素酶活性的影響

(b)虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中纖維素酶活性的影響圖8 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中纖維素酶活性的影響

表7 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS復(fù)合材料對蚯蚓中纖維素酶活性的影響

3 結(jié)論

(1)虎杖提取物的添加只是與PBS進行了共混，并沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng).虎杖提取物的添加促進了復(fù)合材料的結(jié)晶，使得復(fù)合材料的親水性增強且作為給電子基與PBS發(fā)生了分子間作用.在降解過程中，提取物作為小分子物質(zhì)，首先被微生物侵蝕，使得復(fù)合材料與微生物及水分子的接觸面積增大，且加速了水分子的侵入，使得復(fù)合材料的降解速率增加顯著.

(2)虎杖提取物、虎杖提取物/PBS復(fù)合材料能夠?qū)︱球局械牡鞍踪|(zhì)的合成起到促進作用，但復(fù)合材料的影響略大于提取物本身.同時兩者均可增強蚯蚓中過氧化氫酶(CAT)、纖維素酶的活性，整個急性、慢性實驗周期評價基本一致.

(3)所得研究中可通過研磨、提純、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即可得到粉末狀虎杖提取物，提取方法簡易，成本較低.復(fù)合材料制備工藝簡單，但可以達到既能對PBS染色，又可賦予PBS材料良好降解性的雙功能性，提高了產(chǎn)品附加值并對環(huán)境友好，在可降解塑料領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景.