牛蒡子粗多糖的提取及其體外抗氧化活性研究

龔 頻， 胡峰瑞， 高浩天， 楊文娟， 常相娜， 陳福欣

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054)

0 引言

牛蒡子(Fructusarctii)又名“大力子”、“鼠粘子”、“惡食”等，是菊科植物牛蒡的干燥成熟果實(shí)[1]，具有清熱解毒、利咽透疹的功效，證見風(fēng)熱表癥兼喉嚨腫痛者，臨床上常用于風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、肺熱咳喘、疽腫痄腮等疾病[2].牛蒡子具有抗癌[3,4]、抗糖尿病[5]、抗炎[6-8]、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥用價(jià)值[9,10]，含有木脂素、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分[11,12]，目前對(duì)牛蒡子的研究多集中在木脂素類化合物，對(duì)多糖的研究尚不深入.多糖作為天然生物大分子，具有抗腫瘤[13]、降糖[14-16]、抗氧化[17]、抗病毒[18]、保護(hù)神經(jīng)[19,20]等廣泛的生物活性，近些年來被廣泛研究和應(yīng)用.

多糖提取的方法主要有熱水回流浸提法、酶輔助提取、微波輔助提取、超聲輔助提取等.熱水回流提取法操作簡(jiǎn)單，但耗時(shí)長(zhǎng)，提取率低，且長(zhǎng)時(shí)間高溫會(huì)使糖降解.酶輔助提取法具有條件溫和、高效、工藝簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)勢(shì)，但受酶活性影響較大[21].超聲提取利用超聲波使細(xì)胞快速破裂，促進(jìn)內(nèi)容物釋放，其操作簡(jiǎn)單、提取率高，被廣泛應(yīng)用于多糖的提取[22].

本研究以牛蒡子為原料，通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取牛蒡子粗多糖的工藝條件，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究，為牛蒡子多糖的開發(fā)和利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 主要材料

牛蒡子，北京同仁堂；石油醚、無水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、氯化鈉、無水葡萄糖、濃硫酸、苯酚、抗敗血酸(Vc)、鐵氰化鉀、三氯化鐵、濃鹽酸、鄰苯三酚、三氟乙酸，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；DPPH，美國(guó)Sigma公司.

1.1.2 主要儀器

HC-150T2型高速多功能粉碎機(jī)，永康市綠可食品機(jī)械有限公司；KQ-250超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲波儀器有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 上海亞榮生化儀器廠；H-1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T2600型紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛蒡子粗多糖的制備

牛蒡子粉碎過篩，經(jīng)石油醚、乙醇除脂脫色后晾干備用.取2 g藥材粉末，按料液比加入蒸餾水，在設(shè)定溫度下超聲輔助提取一定時(shí)間后抽濾，提取2次，合并濾液并濃縮至原體積的1/4，再加4倍體積95%乙醇，于4 ℃沉淀24 h，離心，沉淀用蒸餾水復(fù)溶，冷凍干燥后得牛蒡子粗多糖.

取在最優(yōu)條件下提取的牛蒡子粗多糖，蒸餾水復(fù)溶至合適濃度，使用sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)進(jìn)行脫蛋白[23]處理.

1.2.2 牛蒡子粗多糖得率測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[24]測(cè)含糖量，通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度.按照式(1)計(jì)算出牛蒡子粗多糖得率：

(1)

式(1)中：C為多糖濃度(g/mL)，V為溶液的總體積(mL)，n為稀釋倍數(shù)，W為牛蒡子干粉質(zhì)量(g).

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

設(shè)置基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件為超聲時(shí)間為60 min，提取溫度為70 ℃,料液比1∶20.考察超聲時(shí)間(20、40、60、80、100 min)、提取溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)以及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)牛蒡子粗多糖得率的影響.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以超聲時(shí)間、提取溫度和料液比為自變量，以牛蒡子粗多糖得率為響應(yīng)值Y，通過BOX-Behnken Design(BBD)設(shè)計(jì)方案.

1.2.5 體外抗氧化活性檢測(cè)

(1)自由基清除能力檢測(cè)

檢測(cè)牛蒡子粗多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子的清除率.分別配置牛蒡子粗多糖和Vc溶液(不同濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL)，調(diào)整已有方法[25]測(cè)定DPPH自由基清除能力.取不同濃度的粗多糖和Vc溶液2 mL置于具塞刻度試管中，加入0.05 mg/mL的DPPH無水乙醇溶液2 mL，搖勻，室溫避光放置30 min后，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度；

參照文獻(xiàn)[26]中所述方案并進(jìn)行調(diào)整來測(cè)定羥基自由基清除能力.取不同濃度的粗多糖和Vc溶液2 mL置于具塞刻度試管中，依次加入2 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)、2 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)和2 mL過氧化氫溶液(9 mmol/L)，搖勻，37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度；

超氧陰離子的清除能力參考已報(bào)道的方法[27].取不同濃度的粗多糖和Vc溶液各200μl于具塞刻度試管中，加入3 mL Tris-HCl溶液(0.1 mol/L)，37 ℃水浴加熱10 min，加入12μL鄰苯三酚溶液(30 mmol/L)反應(yīng)4 min后立即加入0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值.各試驗(yàn)以Vc為陽性對(duì)照，每個(gè)樣做3個(gè)平行，按照公式(2)計(jì)算樣品對(duì)每種自由基的清除率.

(2)

式(2)中：A2為樣品溶液的吸光度；A1為樣品本底吸光度；A0為空白對(duì)照吸光度.

(2)總還原力檢測(cè)

配置不同濃度的牛蒡子粗多糖和Vc溶液，總還原力的測(cè)定參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[28]，以Vc作為陽性對(duì)照，每個(gè)樣本平行3次，于700 nm處測(cè)吸光度.

1.3 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)平行3次，使用Microsoft Excel 2020、Design-Expert 8.0.6和Origin 8.5軟件對(duì)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)和抗氧化試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)粗多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)牛蒡子粗多糖得率的影響見圖1(a)所示.由圖可知,隨超聲時(shí)間的增加，多糖得率逐漸上升，在60 min時(shí)達(dá)到最高，隨之又開始逐漸降低，或是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長(zhǎng)使得多糖結(jié)構(gòu)被破壞[29].最優(yōu)的超聲時(shí)間為60 min時(shí)得率最高為13.19%.

提取溫度的改變對(duì)牛蒡子粗多糖得率的影響見圖1(b)所示.由圖可知,初始時(shí)多糖得率隨溫度的增加而增加，在提取溫度達(dá)到80 ℃時(shí)多糖得率達(dá)到最大值13.98%，而過多糖得率開始降低，推測(cè)提取溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)會(huì)被水解破壞[30].初步確定最優(yōu)的提取溫度是80 ℃.

料液比的改變對(duì)牛蒡子粗多糖得率的影響見圖1(c)所示.由圖可知，在低于1∶25 g/mL時(shí)，多糖得率隨料液比的增加而增加，在料液比達(dá)到1∶25 g/mL時(shí)多糖得率達(dá)到最大值13.81%，而后隨著料液比的增加多糖得率開始降低，可能是因?yàn)槎嗵菢O性大，易溶于水，料液比太小會(huì)溶出不完全，而料液比過大會(huì)導(dǎo)致其他水溶性物質(zhì)溶出.因此最優(yōu)的料液比選擇為1∶25 g/mL.

(a)超聲時(shí)間對(duì)牛蒡子粗多糖得率的影響

(b)提取溫度對(duì)牛蒡子粗多糖得率的影響

(c)料液比對(duì)牛蒡子粗多糖得率的影響圖1 超聲時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

通過BBD設(shè)計(jì)出牛蒡子粗多糖的優(yōu)化工藝方案進(jìn)行多元回歸擬合，獲得多糖得率響應(yīng)值Y對(duì)超聲時(shí)間(A)、提取溫度(B)及料液比(C)的回歸方程：

Y=14.21+0.47A+0.2B+0.068C-0.24AB+0.14AC-1.61A2-0.22B2-0.51C2.

采用Design-Expert對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明(表1)，該模型的P<0.000 1，具有極顯著性，失擬項(xiàng)不顯著(p=0.315 4)，R2=0.996，可信度極高，說明模型可用于優(yōu)化提取多糖的工藝.一次項(xiàng)A和B、交互項(xiàng)AB以及平方項(xiàng)A2、B2、C2的P值都小于0.01，說明各因素對(duì)牛蒡子粗多糖得率具有極顯著的影響，且影響的主次順序?yàn)锳>B>C，即超聲時(shí)間>提取溫度>料液比.

表1 回歸方程方差分析

通過Design-Expert分析各因素交互作用的響應(yīng)面分析圖見圖2所示.相應(yīng)曲面圖越陡峭，坡度越大，說明因素交互作用越顯著，反之越平緩，坡度越小，說明交互作用顯著性越低[31].圖2結(jié)果表明，超聲時(shí)間曲線變化最大，對(duì)多糖提取率的影響最明顯.響應(yīng)曲面圖彎曲程度為AB>AC>BC.提取時(shí)間和提取溫度響應(yīng)面坡度最陡峭，等高線呈橢圓狀，說明其對(duì)多糖的提取率影響最為顯著.

(a)超聲時(shí)間和提取溫度響應(yīng)面

(b)超聲時(shí)間和提取溫度等高線圖

(c)超聲時(shí)間和料液比響應(yīng)面

(d)超聲時(shí)間和料液比等高線圖

(e)提取溫度和料液比響應(yīng)面

(f)提取溫度和料液比等高線圖圖2 兩兩因素交互作用對(duì)牛蒡子粗多糖得率的響應(yīng)面和等高線

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

Design-Expert預(yù)測(cè)牛蒡子粗多糖的最優(yōu)提取工藝條件為超聲時(shí)間62.42 min、提取溫度為83.89 ℃、料液比為1∶25.42 g/mL，該條件下牛蒡子粗多糖得率為14.28%.根據(jù)實(shí)際條件調(diào)整提取工藝條件為超聲時(shí)間63 min、提取溫度為84 ℃、料液比為1∶25 g/mL，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，平行3次，所得到的牛蒡子粗多糖平均得率為14.02%，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)值相近，說明該模型所優(yōu)化的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定可行.

2.4 牛蒡子粗多糖抗氧化活性

DPPH可以被具有抗氧化性的活性物質(zhì)清除，且自由基清除率與該物質(zhì)抗氧化能力呈正相關(guān).由圖3(a)可知，Vc具有很強(qiáng)的清除能力，牛蒡子粗多糖對(duì)DPPH也呈現(xiàn)出一定的清除能力，并且在一定的濃度范圍內(nèi)存在量效關(guān)系.在最高濃度下清除率達(dá)到58.89%；羥基自由基性質(zhì)活潑，得電子能力極強(qiáng)，是活細(xì)胞中主要的活性氧自由基.

牛蒡子粗多糖對(duì)羥基自由基清除能力檢測(cè)結(jié)果如圖3(b)所示.從總體趨勢(shì)來講，隨著多糖濃度的增加，羥基自由基的清除率呈上升趨勢(shì).但與陽性對(duì)照Vc相比清除效果較弱，在最高濃度下清除率達(dá)到63.61%；超氧陰離子會(huì)損傷機(jī)體組織和細(xì)胞功能，具有強(qiáng)氧化性.

牛蒡子粗多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力檢測(cè)結(jié)果如圖3(c)所示.由圖可知，不同濃度Vc對(duì)超氧陰離子清除率較高，F(xiàn)AP對(duì)超氧陰離子有一定的清除能力，且在一定的濃度范圍內(nèi)存在量效關(guān)系,在最高濃度下清除率達(dá)到82.53%.

牛蒡子粗多糖對(duì)鐵離子的還原能力檢測(cè)結(jié)果如圖3(d)所示.由圖可知，隨著濃度的升高，還原能力逐漸增大.但其還原能力與陽性對(duì)照Vc相比明顯較弱，在最高濃度下還原能力達(dá)到0.197 5.

(a)牛蒡子粗多糖對(duì)DPPH的清除率

(b)牛蒡子粗多糖對(duì)羥自由基的清除率

(c)牛蒡子粗多糖對(duì)超氧陰離子的清除率

(d)牛蒡子粗多糖對(duì)鐵離子的還原力圖3 牛蒡子粗多糖對(duì)DPPH、羥基自由、超氧陰離子的清除率和對(duì)鐵離子的還原能力

3 結(jié)論

(1)通過超聲輔助-水提醇沉法獲得牛蒡子粗多糖，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得牛蒡子粗多糖最佳制備工藝參數(shù)為超聲時(shí)間63 min、提取溫度84 ℃、料液比1∶25 g/mL，在該條件下制備的牛蒡子粗多糖得率可達(dá)到14.02%.

(2)通過對(duì)DPPH自由基、羥基自由基及超氧陰離子的清除能力和鐵離子還原能力的檢測(cè)，評(píng)價(jià)了牛蒡子粗多糖的體外抗氧化活性，結(jié)果說明牛蒡子粗多糖具有良好的抗氧化活性.

(3)通過研究牛蒡子粗多糖的提取工藝和抗氧化活性，為牛蒡子多糖的開發(fā)利用提供了具體的科學(xué)理論基礎(chǔ)，為牛蒡子多糖保健食品、藥品的開發(fā)提供了理論依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步挖掘牛蒡子的資源應(yīng)用提出新思路.