產(chǎn)前抗生素暴露對晚期早產(chǎn)兒腸道菌群的影響

朱云蕾， 黃清梅， 黃桂連， 陳玉君

人類腸道存在復雜、多樣和動態(tài)的微生物群落。腸道微生物群在抵抗腸道病原體定植、培養(yǎng)和促進宿主免疫系統(tǒng)成熟以及宿主代謝方面發(fā)揮不可或缺的作用[1]。嬰兒腸道微生物群從出生起開始建立，容易受到多種圍產(chǎn)期因素的影響，包括分娩方式、喂養(yǎng)類型、胎齡和抗生素用藥等[2-3]。研究顯示，約25%的女性在懷孕期間接受過一個療程的抗生素治療，抗生素約占妊娠期所用處方藥物的80%[4]。目前，越來越多的研究認為母親產(chǎn)前使用抗生素是影響新生兒腸道菌群建立的因素之一[5]。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)探討產(chǎn)前抗生素暴露對晚期早產(chǎn)兒腸道菌群的影響，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2020年3月至2021年5月在廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院住院治療的晚期早產(chǎn)兒13例，胎齡340/7～366/7周。其中5例早產(chǎn)兒母親產(chǎn)前使用過抗生素(觀察組)，平均療程為(2.20±1.10)d，余8例早產(chǎn)兒母親產(chǎn)前未使用過抗生素(對照組)。早產(chǎn)兒出生后均為混合喂養(yǎng)，兩組在分娩方式、胎齡、性別、出生體重等方面比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。研究獲早產(chǎn)兒父母或法定監(jiān)護人知情同意。

表1 兩組一般情況比較

1.2納入與排除標準 觀察組納入標準：(1)34周≤胎齡<37周；(2)出生后即轉(zhuǎn)入新生兒科住院治療；(3)母親產(chǎn)前2周內(nèi)使用過β-內(nèi)酰胺類抗生素(五水頭孢唑林鈉)。對照組納入標準：(1)出生后即轉(zhuǎn)入新生兒科住院治療；(2)母親產(chǎn)前2周內(nèi)未使用抗生素；(3)性別、胎齡、分娩方式、出生體重與觀察組相匹配。排除標準：(1)合并嚴重復雜的先天性心臟病、唐氏綜合征、遺傳代謝病或重度窒息；(2)合并壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)、敗血癥、腹裂、胃腸道穿孔、消化道畸形需手術(shù)治療者；(3)糞便標本收集期間早產(chǎn)兒接受抗生素及益生菌治療。

1.3標本采集 采用無菌通便的方法，使用無菌糞便采集杯收集日齡為3(D3)、7(D7)、14(D14)天的嬰兒糞便標本，-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)錂z。

1.4細菌DNA提取與測序 采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，美國)提取糞便細菌基因組DNA，檢測DNA純度、濃度及完整性。通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法擴增16SrRNA的V3-V4區(qū)。應(yīng)用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序，測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5生物信息分析 對Illumina Miseq PE300平臺獲得的原始序列進行質(zhì)控和拼接。應(yīng)用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units,OUT)聚類。基于RDP classifier貝葉斯算法進行分類學分析，根據(jù)結(jié)果，分析各組腸道菌群的多樣性指數(shù)及物種組成。

1.6觀察指標 (1)采用Shannon指數(shù)進行多樣性分析，其值越大，說明菌群多樣性越高。(2)通過分析腸道菌群在門、屬水平的相對豐度來描述其物種組成。

數(shù)(n)表示，組間比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1測序結(jié)果 共收取39份糞便樣本，其中觀察組有1例D3日齡的糞便樣本PCR擴增失敗。38份測序樣本經(jīng)處理后共得到1 081 366條優(yōu)化序列，所檢測到的腸道菌群隸屬于1域、1界、11門、20綱、35目、64科、132屬、217種、324 OUT。

2.2兩組D3、D7、D14日齡嬰兒Shannon指數(shù)比較

在D3、D7、D14，兩組Shannon指數(shù)隨嬰兒日齡的增長而上升，觀察組Shannon指數(shù)始終低于對照組，但僅在D3時觀察組Shannon指數(shù)與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.717，P=0.007)。見圖1。

2.3兩組腸道菌群門水平比較 隨著嬰兒日齡的增長，對照組變形菌門占比降低而觀察組占比升高；對照組厚壁菌門占比升高而觀察組占比降低。在D3、D7、D14日齡，對照組擬桿菌門占比呈先降低后升高的趨勢，而觀察組呈逐漸升高的趨勢。兩組放線菌門占比均隨嬰兒日齡的增長而升高。見圖2。

圖1 兩組D3、D7、D14日齡嬰兒Shannon指數(shù)比較圖

圖2 兩組腸道菌群門水平比較圖

2.4兩組腸道菌群屬水平比較 隨著嬰兒日齡的增長，對照組腸球菌屬占比逐漸增加，觀察組腸球菌屬水平呈先增高再降低趨勢。對照組克雷伯桿菌屬占比先增加后降低，而觀察組克雷伯桿菌屬占比逐漸增加。觀察組副擬桿菌屬水平呈先增高再降低趨勢，而對照組幾乎檢測不到副擬桿菌屬。在D3時，與對照組比較，觀察組雙歧桿菌屬定植減少，厭氧芽胞桿菌屬、腸桿菌屬及克呂沃爾氏菌屬定植延遲。見圖3。

圖3 兩組腸道菌群屬水平比較圖

3 討論

3.1抗生素對現(xiàn)代醫(yī)學具有重要意義，其在維護人類健康方面發(fā)揮了重要作用。然而，人們也越來越擔心使用抗生素所帶來的負面效果，包括對腸道菌群造成的損害。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，觀察組腸道菌群的多樣性和豐富度均顯著降低，在D3日齡時，對照組Shannon指數(shù)顯著高于觀察組，表明產(chǎn)前抗生素暴露可降低早產(chǎn)兒腸道菌群的多樣性，這與國外多項研究結(jié)果[6-8]相似。在本研究期間，觀察組Shannon指數(shù)始終低于對照組，但僅在D3差異有統(tǒng)計學意義，這可能與產(chǎn)前抗生素暴露對早產(chǎn)兒腸道菌群的影響減弱有關(guān)，早產(chǎn)兒腸道菌群在其他影響因素及自身調(diào)節(jié)下，菌群多樣性逐漸恢復。在門水平上，對照組變形菌門占比逐漸降低，厚壁菌門占比逐漸升高，而觀察組則成相反趨勢變化。在屬水平上，D3日齡時，觀察組菌屬多樣性單一，以腸球菌屬、埃希菌-志賀菌屬、葡萄球菌屬為主，部分腸道共生菌如雙歧桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、檸檬酸桿菌屬等定植延遲，表明產(chǎn)前使用抗生素可影響早產(chǎn)兒腸道菌群的正常定植，抑制腸道細菌的生長，使早產(chǎn)兒腸道部分有益菌如雙歧桿菌定植延遲，這與Zou等[9]的研究結(jié)果相似。Stearns等[7]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前抗生素暴露使雙歧桿菌定植延遲且相對豐度降低，這種影響可持續(xù)至產(chǎn)后6周，較本研究的恢復時間慢，這可能因該研究對象抗生素暴露時間及抗生素使用種類與本研究不同有關(guān)。

3.2多項研究表明，產(chǎn)前抗生素暴露的足月兒腸道變形菌門相對豐度增加，放線菌門和擬桿菌門相對豐度減少,但厚壁菌門相對豐度變化存在爭議[7，10-11]。本研究觀察到抗生素暴露的早產(chǎn)兒變形菌門相對豐度日益上升，厚壁菌門相對豐度日益降低。變形菌門中有害菌屬多于有益菌屬，腸道中變形菌門的增多反映了腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定或生態(tài)失調(diào)[12]，由此推測，產(chǎn)前抗生素暴露可能與早產(chǎn)兒腸道菌群失調(diào)有關(guān)。另外，變形菌門豐度上升和厚壁菌門豐度降低也可能增加NEC的發(fā)生率[13]。副擬桿菌屬是一類革蘭陰性厭氧菌，是人體核心菌群之一，其對多種β-內(nèi)酰胺類抗生素具有廣泛的耐藥性[14-15]。也有研究顯示產(chǎn)前抗生素暴露與新生兒抗生素耐藥增加有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，產(chǎn)前抗生素暴露使早產(chǎn)兒副擬桿菌屬豐度增加，提示臨床醫(yī)師需要關(guān)注孕期抗生素的使用與新生兒產(chǎn)生抗生素耐藥之間的關(guān)系。

3.3抗生素暴露可能對新生兒產(chǎn)生不良影響，如引起支氣管肺發(fā)育不良[16]、肥胖[17]、哮喘[18]、濕疹[19]和早發(fā)性敗血癥[20]等，提示臨床上需要權(quán)衡孕婦產(chǎn)前抗生素治療的利弊。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，給予早產(chǎn)兒補充益生菌能增加其腸道微生物的多樣性，促進腸道有益菌的定植[21]，提示有可能通過補充益生菌制劑來改善產(chǎn)前抗生素暴露嬰兒腸道正常菌群的建立。但本研究也存在一些不足：(1)病例樣本偏少，觀察時間較短，未能觀察產(chǎn)前抗生素暴露對晚期早產(chǎn)兒腸道菌群的遠期影響；(2)所有樣本均來源于母親產(chǎn)前預防性使用抗生素，抗生素使用時間較短，未能了解到更長時間抗生素暴露對晚期早產(chǎn)兒腸道菌群的影響。這些問題有待進一步研究。

綜上所述，產(chǎn)前抗生素暴露可影響早產(chǎn)兒腸道菌群的建立，改變其多樣性和豐富度，使早產(chǎn)兒腸道菌群多樣性降低，腸道共生菌定植延遲，提示臨床醫(yī)師需謹慎考慮對孕婦予以抗生素治療，以防對新生兒產(chǎn)生不良影響。