阿托伐他汀對慢性子宮內(nèi)膜炎大鼠的治療作用及其機制研究

謝 昕， 王嘉偉， 趙蘊肖， 秦蓉燕， 覃韋麗， 李艷慧， 鄧 榮， 覃愛平

慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis，CE)是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一種持續(xù)性炎性疾病，多數(shù)患者臨床癥狀輕微，部分患者可表現(xiàn)為盆腔疼痛、異常子宮出血、白帶增多等癥狀，容易被醫(yī)師忽視[1]。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)CE與異常子宮出血、子宮內(nèi)膜增生、宮腔粘連等疾病的發(fā)生、發(fā)展相關[2-4]。目前，CE的主要治療方法是口服抗生素，但由于其病程較長，長時間使用抗生素會增加患者發(fā)生耐藥性的風險，引起病情反復發(fā)作[5]。阿托伐他汀是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是降低血清膽固醇水平和預防心血管疾病的常用藥物之一[6]。近年來有研究證實阿托伐他汀還具有抗炎、抗氧化應激等功能[7]。但關于阿托伐他汀對CE的治療效果的研究尚少見報道，本研究旨在探討阿托伐他汀對CE的治療作用以及其可能機制，為CE治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物和分組 選擇無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，體質(zhì)量180～220 g，均購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。將其隨機分為假手術(shù)組、模型組、阿托伐他汀低劑量組(10 mg/kg)和阿托伐他汀高劑量組(20 mg/kg)，每組8只。本研究獲得廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(編號：202107002)。

1.2藥物和試劑 阿托伐他汀鈣片購自輝瑞制藥公司。免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自北京中衫金橋公司。Trizol購自北京索萊寶公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Monad公司。白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體購自英國Abcam公司?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗體購自正能生物公司。

1.3大鼠CE模型建造方法[8-9]大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行造模。予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，作長約1 cm的腹部正中切口，開腹后暴露雙側(cè)子宮，選用4號針頭于子宮分叉處進入宮腔內(nèi)，朝卵巢方向緩慢推注0.05 ml苯酚膠漿(液化苯酚5 ml，西黃耆膠1 g，甘油4 ml，加蒸餾水配至20 ml)，針頭停留10 s再緩慢拔出，以防止苯酚膠漿滲漏。模型組、阿托伐他汀低劑量組和高劑量組均按上述方法建造CE模型。假手術(shù)組僅行開腹手術(shù)及子宮暴露，不注射苯酚膠漿造模。

1.4藥物干預 完成造模后所有大鼠正常喂養(yǎng)1周，第8天開始灌胃給藥：阿托伐他汀低劑量組予10 mg/kg阿托伐他汀，阿托伐他汀高劑量組予20 mg/kg阿托伐他汀，模型組和假手術(shù)組予等體積生理鹽水灌胃。大鼠灌胃給藥容積均為1 ml/100 g，1次/d，連續(xù)干預14 d。

1.5大鼠子宮病理學檢測 連續(xù)給藥14 d后，以過量麻醉法(3%戊巴比妥鈉，90 mg/kg)處死大鼠。取大鼠子宮組織，4%多聚甲醛固定液固定24 h，脫水后包埋于石蠟中。切片厚度為5 μm，經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察。觀察內(nèi)容包括[9]：(1)子宮內(nèi)膜上皮細胞增生情況；(2)上皮細胞變性、壞死情況；(3)子宮內(nèi)膜炎癥細胞浸潤情況；(4)子宮內(nèi)膜充血、水腫情況。并按照病變發(fā)生的嚴重程度分為正常、輕度、中度和重度，分別以0、1、2、3分進行評分[9]。

1.6IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平。按照Trizol使用說明書提取組織總RNA，應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行RT-qPCR，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。引物由生工生物公司合成，序列見表1。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.7IL-1β和MMP-9蛋白表達水平檢測 采用免疫組化法檢測子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白的表達水平。將切片置入60 ℃烤箱中，烤片1 h，脫蠟、水化后浸入檸檬酸鈉緩沖液經(jīng)高壓加熱修復抗原，冷卻后以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)進行沖洗。滴加3% H2O2孵育15 min，PBS洗片。在距離組織3 mm處，使用免疫組化筆畫圈，滴加正常山羊血清室溫封閉15 min。甩干封閉液，滴加一抗液，將玻片置于濕盒中以防止干片，4 ℃孵育過夜。復溫后用PBS沖洗，滴加生物素標記的二抗液，濕盒室溫孵育15 min后以PBS進行沖洗。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素，濕盒內(nèi)室溫孵育15 min。PBS洗片，滴加DAB顯色液孵育2 min，自來水沖洗，蘇木精復染，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。以細胞染色強度、陽性細胞百分比作為半定量評分標準進行結(jié)果判讀[10]。細胞染色強度評分：無明顯著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將兩項評分相加得出最終評分結(jié)果，0～2分記為陰性；≥3分記為陽性。

2 結(jié)果

2.1四組大鼠子宮組織病理改變情況比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞出現(xiàn)增生、變性、壞死改變，且內(nèi)膜有不同程度的水腫和充血病變,并伴有中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞不同程度的浸潤，提示CE模型制備成功。與模型組比較，阿托伐他汀高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞增生、變性壞死、炎細胞浸潤情況得到顯著改善。見圖1，表2。

?假手術(shù)組；?模型組；?阿托伐他汀低劑量組；?阿托伐他汀高劑量組

表2 四組大鼠子宮組織病理改變情況比較(n)

2.2四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，阿托伐他汀低劑量組和阿托伐他汀高劑量組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，但阿托伐他汀高劑量組與阿托伐他汀低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9 mRNA

2.3四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白陽性表達情況比較 IL-1β和MMP-9主要表達于子宮內(nèi)膜組織中腔上皮及腺上皮細胞的細胞質(zhì)和細胞膜。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織的IL-1β和MMP-9蛋白的陽性表達率更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，阿托伐他汀低劑量組、阿托伐他汀高劑量組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白陽性表達率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但阿托伐他汀高劑量組與阿托伐他汀低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2，表4。

?假手術(shù)組；?模型組；?阿托伐他汀低劑量組；?阿托伐他汀高劑量組

表4 四組大鼠子宮組織IL-1β和MMP-9蛋白陽性表達情況比較[n(%)]

3 討論

3.1CE屬于盆腔炎性疾病的一種，易反復發(fā)作，嚴重影響女性生活質(zhì)量。有研究顯示，2.8%～46.0%的不孕患者遭受CE的困擾[11-14]。未經(jīng)治療的CE患者，自然受孕和人工授精的成功率低，甚至可能導致產(chǎn)科并發(fā)癥[15]。目前認為，CE的致病原因主要為微生物感染，內(nèi)膜組織病原體培養(yǎng)可明確CE病原體，治療首選的抗生素為多西環(huán)素，若使用后癥狀未改善時可使用甲硝唑聯(lián)合環(huán)丙沙星治療[16]。有研究報道，25%的CE患者在接受抗生素治療后癥狀并未得到好轉(zhuǎn)[17]。且長期服用抗生素容易產(chǎn)生耐藥性，因此亟需尋找新的CE治療方案。

3.2他汀類藥物是治療高膽固醇血癥的臨床一線藥物，通過抑制膽固醇合成限速酶減少膽固醇的合成，可顯著降低低密度脂蛋白膽固醇和血清甘油三脂水平[18]。阿托伐他汀是全合成他汀類藥物，具有毒性低、安全性較好的優(yōu)點。Satoh等[19]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以通過減少炎癥因子IL-1β和白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)的分泌，在冠狀動脈病變(coronary artery disease，CAD)患者中發(fā)揮抗炎作用。Malekinejad等[20]研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以降低肺炎模型小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的表達，并且能夠減輕肺損傷程度和巨噬細胞滲出。Simsek等[21]發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型中，阿托伐他汀可通過其抗炎作用減輕子宮內(nèi)膜異位癥癥狀。而Takebayashi等[22]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者CE的發(fā)生率顯著高于非子宮內(nèi)膜異位癥患者，表明子宮內(nèi)膜異位癥與CE的發(fā)生、發(fā)展具有關聯(lián)性。但關于阿托伐他汀對CE治療的效果研究，國內(nèi)外尚鮮見報道。本研究HE染色結(jié)果顯示，給予高劑量阿托伐他汀治療后，CE大鼠的子宮上皮細胞增生、變性壞死、炎細胞浸潤的病理情況均獲改善，表明阿托伐他汀可有效治療CE。

3.3有研究顯示，與正常女性比較，IL-1β和MMP-9在CE患者中的表達顯著升高，提示這兩種細胞因子在CE疾病進展中起重要作用[23-26]。IL-1β作為主要的促炎細胞因子，由單核細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生，參與調(diào)節(jié)宿主的天然免疫反應[27]。當發(fā)生CE時，IL-1β分泌異常增加，與Ⅰ型白細胞介素1受體結(jié)合后，誘發(fā)一系列炎癥介質(zhì)和相關趨化因子的釋放，可引起子宮內(nèi)膜異常免疫反應、炎癥細胞外滲和遷移[28-29]?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)能影響細胞外基質(zhì)的重塑和細胞遷移，在組織修復、炎癥反應和腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用，基質(zhì)金屬蛋白酶的組織特異性抑制物(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)能特異性地抑制MMPs[30]。在眾多MMPs中，MMP-9被認為是調(diào)節(jié)白細胞和巨噬細胞遷移的主要細胞因子之一，是炎癥反應的重要調(diào)節(jié)劑[31]。研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜炎小鼠模型中，干擾素-τ(interferon-tau,IFN-τ)通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor kappa-B,NF-κB)信號通路和MMP-9的表達發(fā)揮抗炎作用[32]。Inagaki等[33]發(fā)現(xiàn)，與可育女性相比，反復種植失敗的女性患者MMP-9、IL-1β水平顯著升高，導致子宮內(nèi)膜環(huán)境變化，影響胚胎著床。且Yoshii等[34]在一項回顧性研究中證明，在反復種植失敗女性患者中可以通過降低MMPs表達水平而改善子宮炎癥環(huán)境，從而提高臨床妊娠率。本研究結(jié)果顯示，阿托伐他汀低、高劑量組大鼠子宮組織中IL-1β和MMP-9 mRNA和蛋白表達水平顯著低于CE模型組，表明阿托伐他汀可以降低CE大鼠IL-1β和MMP-9的表達。

綜上所述，阿托伐他汀對CE大鼠具有治療作用，其機制可能與下調(diào)子宮組織IL-1β和MMP-9表達水平、減輕子宮內(nèi)膜慢性炎癥有關。