響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉黃酮萃取工藝及其抗氧化研究

姚 曦，岳永德，湯 鋒

(國(guó)際竹藤中心，北京 100102)

響應(yīng)面法優(yōu)化竹葉黃酮萃取工藝及其抗氧化研究

姚 曦，岳永德，湯 鋒

(國(guó)際竹藤中心，北京 100102)

利用微波提取慈竹葉中總黃酮類(lèi)化合物。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法研究微波提取的最佳工藝條件。結(jié)果表明，以80%的乙醇為提取溶劑，微波提取最佳條件為:提取溫度70℃、提取時(shí)間10.5min、液固比為34∶1mL/g;在此工藝條件下，慈竹葉總黃酮得率為1.381%?？寡趸钚匝芯勘砻?，慈竹竹葉總黃酮DPPH·清除作用較好，其IC50值為141.5mg/L，優(yōu)于相同濃度的2，6－二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)。

竹葉，總黃酮，微波輔助提取，響應(yīng)面法，抗氧化活性

竹子屬于單子葉植物(Monocotyledoneae)中的禾本目 (Graminales)禾本 科 (Poaceae)竹 亞科(Bambusoideae)，在我國(guó)有著悠久的藥用歷史?！侗静菥V目》記載:“淡竹葉氣味辛平，大寒，無(wú)毒;主治:心煩、尿赤、小便不利等?？嘀袢~氣味苦冷、無(wú)毒;主治口瘡、目痛、失眠、中風(fēng)等”。近些年來(lái)研究［1］表明竹葉中含有黃酮類(lèi)化合物，因其具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎抑菌、降低膽固醇等多種藥理活性，其藥用價(jià)值日益被人們所重視。微波輔助萃取(MAE)是近年來(lái)發(fā)展較快的新型提取方法，具有高效性、提取時(shí)間短、能耗低、節(jié)約溶劑等特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外已被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境、天然活性成分等提?。?－4］。很多文獻(xiàn)報(bào)道了應(yīng)用微波萃取植物中的總黃酮成分，如對(duì)葛根［5］、山楂葉［6］、滿山紅葉［7］、黨參［8］等的總黃酮的萃取。近年來(lái)，不少學(xué)者對(duì)竹葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取技術(shù)進(jìn)行了多方面積極和有益的探索，但主要集中在對(duì)傳統(tǒng)提取方法的優(yōu)化改良上［9－11］，有關(guān)微波輔助提取的文獻(xiàn)報(bào)道少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面分析法(Response Surface Analysis，RSA)，并采用Box－Benhnken Design的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［12－13］，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)擬合數(shù)學(xué)模型進(jìn)行描述，篩選出微波提取竹葉總黃酮的最佳工藝條件，同時(shí)對(duì)慈竹竹葉總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為竹資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

慈竹(Neosinocalamus affinins)竹葉 采自四川綿竹，自然陰干后再于60℃烘干至恒重后，于高速粉碎機(jī)粉碎，取過(guò)60目篩的竹粉于干燥器內(nèi)備用。

微波消解儀 美國(guó)CEM公司MARS－5型;紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)PE公司6400型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立［14］精確稱(chēng)取于120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.01g，用80%乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，配制成0.1g/L的蘆丁對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的蘆丁對(duì)照品溶液于10mL容量瓶中，用乙醇補(bǔ)充至5.0mL;加入0.1mol/L氯化鋁溶液4mL，最后用30%乙醇補(bǔ)充至刻度，搖勻后放置15min;以相應(yīng)試劑做空白，于406nm處測(cè)定吸光度，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 竹葉黃酮的提取及含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取竹葉樣品0.60g，置于微波提取罐中，按一定液固比加入溶劑。分別按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行萃取，儀器設(shè)定為控溫模式，微波功率為600W［15－17］。反應(yīng)后冷卻至室溫取出，過(guò)濾，定容到25mL容量瓶中，取待測(cè)液1.0mL，置于10mL容量瓶中，用溶劑補(bǔ)充到5.0mL，按照測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的方法測(cè)定其吸光度A。

1.2.3 竹葉黃酮得率計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，由吸光度A計(jì)算出黃酮質(zhì)量濃度c，竹葉總黃酮得率Y/(mg·g－1)則由下式計(jì)算:

式中:c為黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL;10為10倍;25為mL;m為竹葉質(zhì)量，g。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、提取溫度、液固比等因素為考察變量，以總黃酮得率Y為響應(yīng)值，應(yīng)用Design－Expert 8.05軟件，優(yōu)化微波提取竹葉總黃酮的工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box－Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Coded levels of variables of the central composite experimental design(CCD)

1.2.5 竹葉黃酮抗氧化實(shí)驗(yàn) 將待測(cè)抗氧化劑配制成系列溶液，測(cè)定各濃度抗氧化劑對(duì)DPPH自由基清除率，在清除率20%～80%的范圍內(nèi)，繪制清除率對(duì)濃度曲線，計(jì)算出清除率為50%時(shí)的濃度值，即為IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性回歸方程

根據(jù)各濃度蘆丁對(duì)應(yīng)的吸光度，計(jì)算得到線性回歸:A=32.3c－0.0228，相關(guān)系數(shù)R=0.9998。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

黃酮類(lèi)化合物宜溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑中。乙醇無(wú)毒，對(duì)天然藥物細(xì)胞有較強(qiáng)的穿透能力，對(duì)許多成分溶解性能好且能抑制酶的催化作用，所以本研究采用80%乙醇為提取溶劑。

2.2.1 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 在乙醇濃度為80%，液固比為30mL/g，提取時(shí)間為10min的條件下，考察不同提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction ratio

由圖1可以看出，隨著溫度的升高，提取率隨之增加，當(dāng)溫度達(dá)到70℃后，繼續(xù)升溫，提取率略有下降，這可能和黃酮類(lèi)化合物熱穩(wěn)定性有關(guān)，且過(guò)高溫度下提取物中的活性成分容易被破壞，雜質(zhì)溶出量增加，給后續(xù)操作帶來(lái)不便，成本增大。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 在液固比為30mL/g，提取溫度為70℃的條件下，考察微波提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。由圖2可以看出，微波提取時(shí)間在6～10min范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮得率逐漸增加;若進(jìn)一步增加提取時(shí)間，總黃酮得率則有所降低。這說(shuō)明提取時(shí)間過(guò)短，黃酮類(lèi)物質(zhì)還未充分溶出，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一些熱敏性組分被破壞或部分溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇濃度降低而使黃酮類(lèi)化合物提取率降低［18］。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction ratio

2.2.3 液固比對(duì)竹葉總黃酮得率的影響 在提取溫度為70℃，提取時(shí)間為10min的條件下，考察液固比對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液固比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid－to－solid on extraction ratio

由圖3可看出，隨著液固比的增加，總黃酮得率呈現(xiàn)出由低到高，并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。一方面溶劑用量的增加可以增大樣品與溶劑的接觸面，有利于擴(kuò)散速度的提高;另一方面，當(dāng)液固比達(dá)到一定的比例時(shí)，黃酮已經(jīng)基本提取完全，不再溶出。

表3 黃酮提取參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis of extraction factors for Flavoniods extraction

2.3 響應(yīng)面法對(duì)慈竹總黃酮微波提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and results of tests

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到竹葉黃酮得率Y與微波提取各因素變量的二次回歸方程模型為:

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)微波提取慈竹總黃酮的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)各因子的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。此模型的決定系數(shù)R2為0.9976，線性關(guān)系極顯著;一次項(xiàng)中X2、X3的回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明提取時(shí)間和液固比對(duì)總黃酮得率有極顯著影響，與X1相關(guān)顯著，即提取溫度對(duì)響應(yīng)值有顯著影響;交互項(xiàng)X1X2和X1X3的偏回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明提取溫度和提取時(shí)間、提取溫度和液固比的交互項(xiàng)對(duì)總黃酮的得率有極顯著影響;二次項(xiàng)中X12、X22、X3

2的偏回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平。回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該模型回歸極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著(p=0.058＞0.05)，說(shuō)明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好。將表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)此方程所代表的面進(jìn)行分析，可以推測(cè)出優(yōu)化條件在實(shí)驗(yàn)中所覆蓋的區(qū)域，或是指明在哪些方向上再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可得到更好的結(jié)果。

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)面，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析提取溫度、提取時(shí)間和液固比對(duì)黃酮總得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4～圖5。由圖4可以看出，一定范圍內(nèi)，總黃酮得率隨提取溫度和提取時(shí)間的增加而提高，兩者交互作用顯著。根據(jù)動(dòng)力學(xué)理論，時(shí)間的延長(zhǎng)有利于黃酮的充分?jǐn)U散析出，同時(shí)微波功率的提高使得分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速率加快，從而增加了黃酮的析出速率及其得率。因此，適當(dāng)增加提取溫度和提取時(shí)間有助于提高總黃酮的得率。

圖4 Y=f(x1，x2)響應(yīng)面立體圖Fig.4 Response curved surface figure of Y=f(x1，x2)

由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，總黃酮得率隨提取溫度和液固比的增加呈上升趨勢(shì)。液固比的增加能增大液－固兩相黃酮的濃度梯度，從而提高黃酮溶出的速率及其得率。但溶劑量太大會(huì)造成溶劑回收耗時(shí)較長(zhǎng)，能耗高以及資源浪費(fèi)。

2.4 提取工藝條件的確定及可靠性驗(yàn)證

圖5 Y=f(x1，x3)響應(yīng)面立體圖Fig.5 Response curved surface figure of Y=f(x1，x3)

在模型取值范圍內(nèi)選擇最低點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，依模型使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，可得微波提取總黃酮的最佳理論工藝條件為:提取溫度70.28℃，提取時(shí)間10.35min，液固比33.85mL/g，此條件下竹葉總黃酮得率為1.372%。

為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為提取溫度70℃，提取時(shí)間10.5min，液料比34∶1(mL/g)，實(shí)際測(cè)得的總黃酮平均得率為1.381%，與預(yù)測(cè)值基本一致。因此，采用RSA法優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.5 竹材提取物抗氧化實(shí)驗(yàn)效果

最優(yōu)條件下萃取慈竹黃酮提取物和兩種陽(yáng)性對(duì)照溶液的50%清除率的濃度見(jiàn)表4。

表4 慈竹樣品抗氧化測(cè)定IC50值Table 4 IC50values of sample

由表4可知，慈竹總黃酮提取物表現(xiàn)出較好的抗氧化效果，其IC50值為141.5mg/L，抗氧化效果弱于TBHQ，同時(shí)是合成抗氧化劑BHT清除超氧離子能力1.79倍，表現(xiàn)出很較強(qiáng)的抗氧化活性水平。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用RSA法優(yōu)化了微波提取慈竹葉總黃酮的工藝參數(shù)，建立了回歸模型方程，該模型回歸極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好。根據(jù)優(yōu)化提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在乙醇濃度為80%，提取溫度70℃，提取時(shí)間為10.5min，液固比為34∶1(mL/g)的條件下，慈竹葉中的總黃酮提取率為1.381%。采用響應(yīng)面法優(yōu)化的總黃酮微波輔助提取工藝條件對(duì)竹葉黃酮的綜合利用以及黃酮類(lèi)化合物的產(chǎn)業(yè)化具有理論指導(dǎo)意義。萃取得到的竹葉黃酮具有較好的抗氧化能力，可作為一種理想天然抗氧化劑的提取原料，本研究也為竹資源的高附加值利用提供一定的參考依據(jù)。

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Study on optimization of extraction of falconoid from bamboo leaves by response surface analysis and its antioxidant activity

YAO Xi，YUE Yong－de，TANG Feng
(International Centre for Bamboo and Rattan，Beijing 100102，China)

The extraction of total flavoniods fromNeosinocalamus affininsleaves by microwave－assisted extraction was carried out，and the optimal extraction conditions was studied，such as extraction temperature，extraction time and liquid－to－solid ratio，by response surface analysis(RSA)based on single factor tests.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows in the presence of 80%ethanol as solvent，extraction temperature 70℃，extraction time 10.5minutes and liquid－to－solid ratio 34mL/g.Under the optimal conditions，the yield of total flavoniods fromNeosinocalamus affininsleaves reached 1.381%.Antioxidant activities were evaluated by using 1，1－dipheny－l2－picrylhydrazyl(DPPH)radical in vitro.The IC50was 141.5mg/L，and the result showed that the DPPH radical scavenging activity of flavonoids was stronger that of DPPH.

bamboo leaf;total flavoniods;microwave－assisted extraction(MAE);response surface analysis (RSA);antioxidant

TS201.2

B

1002－0306(2012)21－0223－04

2012－03－15

姚曦(1981－)，男，博士生，助理研究員，研究方向:植物化學(xué)、食品分析。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(20100400708);國(guó)際竹藤中心基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(1632010009)。