不同負ORP值堿性電解水理化、抗氧化及緩解胃酸性能研究

夏 瑞 鐘 耕 李 恬 楊萬富 高羽歌

(西南大學食品科學學院，重慶 400000)

自由基過多會導致機體氧化應(yīng)激損傷[1-2]。近年來，清除自由基，提高機體抗氧化能力成為預(yù)防和治療疾病的著眼點。隨著抗氧化劑的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)一些化學合成抗氧化劑存在副作用[3]。因此，尋求天然抗氧化劑，通過飲食調(diào)節(jié)清除自由基成為研究熱點[4]。

堿性電解水(alkaline electrolyzed water，AEW)是飲用水或電解質(zhì)水經(jīng)電解后在陰極生成的高負氧化還原電位堿性水[5-6]。氧化還原電位(oxidation-reduction potential，ORP)作為水溶液獲得或失去電子的趨勢，反映出體系的氧化—還原性(電位為正，為氧化性；電位為負，為還原性)[7]。Shirahata等[8]發(fā)現(xiàn)，還原電位越低(負ORP值越大)，其給電子能力越強，與過氧自由基結(jié)合能力越強。研究[9-10]表明，AEW可以抑制脂質(zhì)過氧化，緩解氧化應(yīng)激損傷。因此具有開發(fā)成為天然抗氧化功能飲料的潛力[11]。目前關(guān)于電解水的研究主要集中于應(yīng)用方面[12-13]，迄今未見對不同負ORP值A(chǔ)EW抗氧化活性比較研究報道。

胃酸過多通常是吸煙飲酒、飲食不當?shù)炔涣忌盍晳T導致，會造成機體產(chǎn)生胸胃灼痛、嘔吐等不良反應(yīng)，嚴重者還會引起其他腸胃疾病[14]。用于治療胃酸過多的藥物包括能減少胃酸分泌的抑酸藥，如奧美拉唑；中和胃酸的抗酸藥，如碳酸氫鈉。這些藥物療效雖好但有較嚴重的副反應(yīng)，不能長期服用[15]。堿性電解水pH呈弱堿性，符合飲用水標準，可作為天然抗酸劑[16-17]。目前，關(guān)于AEW緩解胃酸過多癥的研究還未見報道。

試驗擬以生活飲用水為對照，開展不同負ORP值A(chǔ)EW抗氧化以及中和胃酸過多能力的研究，探究AEW負ORP值與pH值對應(yīng)關(guān)系以及負ORP值和pH值與AEW抗氧化和中和胃酸能力的關(guān)系，旨在為新型飲品的開發(fā)和功能探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

雄性昆明小鼠：SPF級，許可證號為SCXK(湘)2019-0004，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；

抗壞血酸、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：北京索萊寶科技有限公司；

胃蛋白酶：活性3 200～4 500 U/mg，北京索萊寶科技有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純；

試驗用水均為超純水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計：759型，上海菁華科技儀器有限公司；

電解水機：XK-A7型，廣東新康科技有限公司；

pH/ORP計：pHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)：Agilent7700X型，美國安捷倫科技有限公司；

高速分散器：XHF-DY型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

離心機：Eppendorf Centrifuge 5804 R型，德國艾本德科學公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿性電解水制備 使用電解水機電解生活飲用水制得不同負ORP值電解水(水樣1、水樣2、水樣3)。

1.2.2 水質(zhì)理化指標測定 參照GB/T 5750—2006《生活飲用水標準檢驗方法》，檢測水樣水質(zhì)指標。檢測指標包括：pH值、TDS值、ORP值(采用pH/ORP計測定)，電解水中的礦物質(zhì)元素采用ICP-MS法檢測。各組試驗平行測定3次。

1.2.3 抗氧化能力測定 以生活飲用水作比較，測定不同負ORP值A(chǔ)EW水樣1、2、3體外抗氧化活性。

(1)超氧陰離子自由基清除率：參考Saad等[18]的方法，稍作調(diào)整。取pH 8.2 Tris-HCl緩沖溶液5 mL于具塞試管中，(25.0±0.5)℃水浴預(yù)熱20 min，依次加入樣品溶液2 mL 和0.5 mL濃度5.00×10-3mol/L鄰苯三酚溶液(1.0×10-2mol/L HCl溶液配制)，搖勻，25 ℃水浴4 min，320 nm處測定其吸光度A1；超純水2 mL代替上述樣品溶液，測定吸光度A0；以1.0×10-2mol/L HCl參比溶液0.5 mL代替鄰苯三酚溶液，測定吸光度A2。按式(1)計算超氧陰離子自由基清除率。

(1)

式中：

S——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度值；

A1——試驗組吸光度值；

A2——對照組吸光度值。

以維生素C為標品，得到維生素C質(zhì)量濃度x(μg/mL)與超氧陰離子自由基清除率y(%)標準曲線方程為y=0.007 1x+0.028 8，R2=0.999 2，樣品的超氧陰離子清除率結(jié)果以維生素C當量表示(μg維生素C/mL)。

(2)羥自由基清除率：參考Hui等[19]的方法并稍作修改。取2.0 mL樣品液，依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，37 ℃水浴30 min。用同體積超純水代替樣品液作空白組，用同體積超純水代H2O2溶液作對照，510 nm 處測量吸光度值。按式(1)計算羥自由基清除率。

以維生素C為標品，得到維生素C質(zhì)量濃度x(μg/mL)與羥自由基清除率y(%)標準曲線方程為y=0.098 8x+0.319 2，R2=0.999 2，樣品的羥自由基清除率結(jié)果以維生素C當量表示(μg維生素C/mL)。

(3)ABTS自由基清除率：參考Ayseli等[20]的方法，略作調(diào)整。4 mL樣品液與4 mL 0.1 mmol/L ABTS+溶液混合，劇烈震搖，避光放置10 min，734 nm處測定其吸光度，用超純水溶液代替樣品作對照。按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

S——ABTS自由基清除率，%；

A0——對照組吸光度；

A1——試驗組吸光度。

以維生素C為標品，得到維生素C質(zhì)量濃度x(μg/mL)與ABTS自由基清除率y(%)標準曲線方程為y=0.067 9x+0.017 1，R2=0.999 5。樣品ABTS自由基清除率結(jié)果以維生素C當量表示(μg維生素C/mL)。

(4)抑制Fe2+-H2O2誘導小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化能力(丙二醛抑制率)：參考陳思南等[21]的方法，略加修改。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，頸椎脫臼法處死，取新鮮肝臟用預(yù)冷生理鹽水沖洗后加入超純水，高速分散器3 000 r/min勻漿5 min，制成質(zhì)量分數(shù)5%肝勻漿待用。4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取1.0 mL肝勻漿上清液于樣品管，加入0.5 mL樣品液，混勻，37 ℃水浴10 min，加入0.5 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和40 μL 60 mmol/L H2O2溶液作誘導劑，模型管不加樣品溶液，空白管不加誘導劑，將模型管、空白管和樣品管置于37 ℃水浴1 h。再冰浴10 min終止反應(yīng)。向各管加入體積分數(shù)15%三氯乙酸1.0 mL和0.67%硫代巴比妥酸1 mL，混勻，置于100 ℃ 水浴15 min，自來水冷卻，6 000 r/min離心10 min，取上清液于532 nm處測吸光度。按式(3)計算丙二醛抑制率。

(3)

式中：

R——抑制率，%；

A模型、A空白、A樣品——模型管、空白管、樣品管吸光度。

1.2.4 體外模擬緩解胃酸過多能力測定 參考文獻[22-23]稍作修改。

(1)人工胃液的配置：將氯化鈉(2 g)和胃蛋白酶(3.2 mg)溶解于500 mL超純水，加入鹽酸(7 mL)用超純水定容成1 000 mL，定容后調(diào)節(jié)pH至1.2。

(2)不同負ORP值A(chǔ)EW對人工胃液H+的消耗：取上述人工胃液200 mL，加熱保持溶液溫度在(37.0±0.5)℃，加入飲用水、水樣1、水樣2、水樣3以及0.2 g/100 mL 碳酸氫鈉溶液90 mL作對照，100 r/min搖床反應(yīng)5，10，30 min時依次取出，吸取溶液5 mL用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液用于下述測定。

(3)胃酸消耗量測定：將上述濾液置于錐形瓶，以1 g/L 酚紅作指示劑，用0.01 mol/L氫氧化鈉滴定，測定H+濃度，表征胃酸消耗量，按式(4)計算胃酸消耗量。

(4)

式中：

I——胃酸消耗量，mmol/L；

V人工胃液——人工胃液體積，200 mL；

VNaOH——消耗氫氧化鈉體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，SPSSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，通過Spearman法進行相關(guān)性分析，Duncan法進行多組間顯著性分析，采用Origin 2019制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性電解水水質(zhì)

2.1.1 pH、ORP和TDS值 由表1可以看出，電解生活飲用水產(chǎn)生水樣1、2的pH值符合相關(guān)企業(yè)標準，如Q/TZYP 0001S—2019《蘇打水飲料》和Q/LBJX 0002S—2019《蘇打水飲料》。國產(chǎn)的不論是人工調(diào)配還是天然蘇打水，各類標準中，其pH值均要求不得超過9。水樣3 pH過高不符合標準，后續(xù)試驗將其作為對照研究不同負ORP值A(chǔ)EW抗氧化和緩解胃酸能力。AEW的負ORP值則隨水樣的pH值增大而逐漸增大，通過對表1 AEW負ORP值與pH值相關(guān)性分析，表明其呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。有研究[24]報道飲用ORP值低(即負ORP值大)的水，可以降低機體內(nèi)氧化性物質(zhì)的含量及其活性，提高抗氧化酶的活性，有益于人體健康。尹軍等[25]提出ORP<200 mV可作為健康飲用水標準之一。由表1可知，AEW水樣1、2、3的ORP值為負值，顯著低于200 mV(P<0.05)，飲用水的ORP為正值(353 mV)，且顯著高于200 mV(P<0.05)，說明AEW符合健康飲用水標準。濃度為0.01 mol/L的NaOH溶液，其pH值為11.85，為強堿性溶液，但其ORP值為正值(286 mV)；質(zhì)量分數(shù)為0.2%的NaHCO3溶液，其pH為8.96，為堿性溶液，ORP值為正值(273 mV)，均顯著高于200 mV(P<0.05)，說明人工調(diào)制的堿性水不具有抗氧化性能，負ORP值為AEW的特點。

表1 不同水樣水質(zhì)指標?Table 1 Indexes of different water quality

2.1.2 堿性電解水主要礦物質(zhì)元素 由表2可知，AEW水樣1、2、3主要礦物質(zhì)元素含量符合飲用水標準GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》且3種水樣無顯著性差異，表明電解原料相同不同負ORP值對AEW礦物質(zhì)含量無顯著影響，與蔡懷彧[6]對AEW制備條件與礦物質(zhì)含量關(guān)系影響研究結(jié)果一致。3種水樣中礦物質(zhì)含量以鈣含量最高，其次是鈉和鎂，可能與飲用水中礦物質(zhì)含量高低有關(guān)。

表2 不同水樣主要礦物質(zhì)元素含量?Table 2 Content of main mineral elements in different water mg/L

2.2 堿性電解水體外抗氧化能力

2.2.1 超氧陰離子自由基清除率 由圖1可知，不同負ORP值A(chǔ)EW對超氧陰離子自由基清除能力由大到小為水樣3>水樣2>水樣1，且顯著高于未電解飲用水(P<0.01)。其中水樣3對超氧陰離子自由基清除作用最強，其維生素C當量為(53.25±0.76)μg維生素C/mL。飲用水對超氧陰離子自由基具有微弱的清除能力，與陳榮河等[26]的研究結(jié)果一致，推測可能與飲用水中的無機成分含量有關(guān)。對比表2可知，不同負ORP值A(chǔ)EW主要礦物質(zhì)含量除鈣、鉀、鎂顯著低于飲用水外，其他與飲用水相比無顯著性差異。但不同負ORP值A(chǔ)EW對超氧陰離子自由基清除能力大小顯著高于飲用水(P<0.01)，說明AEW中的無機成分對其抗氧化作用無顯著影響，AEW抗氧化作用的主要原因是其負ORP值所致。通過對AEW負ORP值與超氧陰離子自由基清除能力相關(guān)性分析表明AEW負ORP值與超氧陰離子自由基清除能力呈正相關(guān)。說明負ORP值A(chǔ)EW可以清除超氧陰離子等氧自由基，具有一定抗氧化性，且AEW抗氧化能力增強與ORP值大小相關(guān)。這與Shirahata等[8]發(fā)現(xiàn)AEW可以清除活性氧，保護DAN免受氧化損傷的研究結(jié)果一致。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖1 不同水樣的超氧陰離子自由基清除能力Figure 1 Superoxide anion radical scavenging ability of different water samples

2.2.2 羥自由基清除率 由圖2可知，AEW水樣3對羥自由基清除作用最強，水樣2次之，水樣1最低，飲用水對羥自由基無清除作用。對AEW負ORP值與羥自由基清除能力進行相關(guān)性分析，表明AEW負ORP值與羥自由基清除能力呈正相關(guān)。對比相關(guān)研究報道，Hu等[27]發(fā)現(xiàn)AEW能夠緩解大鼠因活性氧(超氧陰離子自由基，OH自由基)引起的氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)出一定的抗氧化性，與試驗結(jié)果相似。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖2 不同水樣的羥自由基清除能力Figure 2 Hydroxyl radical scavenging ability of different water samples

2.2.3 ABTS自由基清除率 由圖3可知，不同負ORP值A(chǔ)EW對ABTS自由基清除率為水樣3>水樣2>水樣1，各組間結(jié)果統(tǒng)計學差異顯著(P<0.05)，且均顯著高于飲用水(P<0.05)。飲用水對ABTS自由基具有一定的清除作用，與盧嬋[7]對3種飲用水抗氧化功能的研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析表明AEW ABTS自由基清除率與其負ORP值呈正相關(guān)。負ORP值A(chǔ)EW具抗氧化活性。Kim等[28]研究發(fā)現(xiàn)AEW可以通過清除自由基緩解小鼠氧化應(yīng)激損失，與試驗結(jié)果相似。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖3 不同水樣的ABTS自由基清除能力Figure 3 ABTS free radical scavenging ability of different water samples

2.2.4 對Fe2+-H2O2誘導的肝勻漿脂質(zhì)過氧化作用的影響 由圖4可知，不同負ORP值A(chǔ)EW水樣均能明顯抑制肝勻漿體系MDA生成，而飲用水對MDA的生成無抑制作用。其中，水樣3對肝勻漿過氧化作用抑制率顯著高于水樣2以及水樣1(P<0.05)，說明不同負ORP值A(chǔ)EW表現(xiàn)出一定的抗脂質(zhì)過氧化性。相關(guān)性分析表明AEW對MDA生成的抑制率與其負ORP值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。劉秋芳等[10]發(fā)現(xiàn)AEW可使D-半乳糖所致的小鼠肝、腎、腦組織MDA的生成量下降，與試驗結(jié)果相似，但其只使用了一種AEW，未對不同負ORP值A(chǔ)EW進行比較研究。

4種抗氧化指標結(jié)果表明，不同負ORP值A(chǔ)EW具有抗氧化性，且表現(xiàn)出較強的超氧陰離子自由基清除能力，自由基清除率大小與AEW負氧化還原電位大小相對應(yīng)。研究[8]發(fā)現(xiàn)，還原電位越低(負ORP值越大)，其供電子能力越強，與過氧自由基結(jié)合能力就越強，因此含較高負ORP的物質(zhì)表現(xiàn)出較強抗氧化作用。不同負ORP值A(chǔ)EW對Fe2+-H2O2誘導肝勻漿體系MDA生成的抑制率隨負ORP值增大而增強。綜上，不同負ORP值A(chǔ)EW表現(xiàn)出抗氧化活性以及抗脂質(zhì)過氧化作用。

2.3 堿性電解水負氧化還原電位與抗氧化指標相關(guān)性分析

AEW負ORP值與ABTS自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率以及MDA抑制率相關(guān)性分析見表3。結(jié)果表明，AEW負ORP值與4種抗氧化指標呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，負ORP值與ABTS自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率以及MDA抑制率相關(guān)系數(shù)分別為0.965(P<0.01)，0.962(P<0.01)，0.920(P<0.01)，0.998(P<0.01)。說明AEW負ORP值與其抗氧化能力存在顯著相關(guān)性，即負ORP值是AEW抗氧化能力的主要原因，負ORP值越大其抗氧化能力越強。

表3 不同負ORP值堿性電解水負ORP值與抗氧化活性的相關(guān)性分析?Table 3 Correlation analysis between ORP value and antioxidant activity of different alkaline electrolyzed water

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖4 不同水樣對Fe2+-H2O2誘導肝勻漿脂質(zhì)過氧化作用的影響Figure 4 Effect of different water samples on lipid peroxidation of liver homogenate induced by Fe2+-H2O2

2.4 對體外人工胃酸過多的緩解作用

由圖5可知，不同負ORP值A(chǔ)EW在人工胃液中反應(yīng)5 min，對體外人工胃酸中和能力均顯著高于飲用水，水樣3顯著高于水樣2與水樣1。與0.2% NaHCO3相比，水樣2與其對體外人工胃酸中和能力相當，水樣1低于0.2% NaHCO3，水樣3高于0.2% NaHCO3。反應(yīng)時間延長至10，30 min，AEW對人工胃液中和作用未減弱，依然維持最初水平，水樣2與0.2% NaHCO3效果相同。因此，不同負ORP值A(chǔ)EW與飲用水相比具有中和胃酸能力，而飲用水作為一種溶劑，對胃酸有一定稀釋作用[22]。NaHCO3作為一種抗酸劑，常用于治療胃酸過多癥，但長期服用會導致胃腸脹氣、腹瀉和便秘，鈉攝入過多易誘發(fā)高血壓[22,29]。AEW水樣2中和胃酸效果與0.2% NaHCO3相當，說明AEW可以作為一種天然抗酸劑，是安全緩解胃酸過多癥的替代方法。通過對AEW pH值和胃酸消耗量的相關(guān)性分析表明AEW中和胃酸能力與pH值呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。Panda等[22]研究發(fā)現(xiàn)較高堿度的植物食品表現(xiàn)出較強的緩解胃酸過多能力，說明pH與緩解胃酸能力相關(guān)，與試驗結(jié)果一致。

小寫字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)圖5 不同水樣對人工胃酸的體外中和能力Figure 5 The neutralization ability of different water samples to artificial gastric acid in vitro

3 結(jié)論

試驗表明不同負氧化還原電位值堿性電解水1、2基本理化指標符合國內(nèi)蘇打水相關(guān)飲用標準，堿性電解水具有抗氧化以及緩解胃酸過多的能力，負氧化還原電位值是堿性電解水具有抗氧化能力機理所在。比較得出水樣2具有較強抗氧化能力，其超氧陰離子自由基、羥自由基、ABTS自由基清除能力分別為(49.06±0.16)，(1.46±0.03)，(3.04±0.08)μg維生素C/mL，MDA抑制率為(20.40±1.56)%，緩解胃酸能力與0.2% NaHCO3相當。可開發(fā)為具有抗氧化和緩解胃酸作用的功能性飲用水，為消費者在飲用水健康需求方面提供新選擇。后續(xù)可進一步對堿性電解水其他功能性質(zhì)及負氧化還原電位值不同對其他功能性質(zhì)的影響進行研究。