進(jìn)境百合種球上3種線蟲的檢疫鑒定研究

楊小鳳 祝秀麗 陸辰晨 邵沛澤 諶運(yùn)清 趙光明 楊萬風(fēng) 汪連軍 潘 杰

（連云港海關(guān)，江蘇連云港 222042）

近年來，我國(guó)花卉產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大，百合、郁金香等廣受人們喜愛。江蘇口岸在全國(guó)花卉種苗進(jìn)口方面占有舉足輕重的地位，其進(jìn)境花卉種球主要來源于荷蘭，多為百合、郁金香、風(fēng)信子和洋水仙等，品種繁多?；ɑ芊N球以活體形式進(jìn)行貿(mào)易與運(yùn)輸，為保持種球活性，進(jìn)境時(shí)一般帶有根和栽培介質(zhì)。線蟲分布廣泛，生存和繁殖能力非常強(qiáng)[1]，在種球及介質(zhì)土中能夠長(zhǎng)期存活并難以徹底清除。2020年，連云港口岸從進(jìn)境百合種球中檢出多種線蟲，其中洞穴長(zhǎng)尾線蟲（Seinura caverna）、毀芽滑刃線蟲（Aphelenchoides blastophthorus）和燕麥真滑刃線蟲（Aphelenchus avenae）為江蘇口岸首次截獲。本文主要對(duì)上述3種線蟲進(jìn)行檢疫鑒定，以期為進(jìn)境花卉種球檢疫監(jiān)管提供參考。

1 材料與方法

1.1 線蟲分離

采用改良貝曼漏斗法，取約100 g剪碎的百合種球或介質(zhì)土，用雙層紗布包裹，輕輕放入盛有水的漏斗中（避免液體渾濁），以水剛好浸透樣品為宜。25℃左右靜置24 h，用凹面皿接取線蟲液約10 mL，在ZEISS Discovery.V8體視顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

在體視顯微鏡下挑取目標(biāo)線蟲至載玻片，熱殺死后制成臨時(shí)玻片，在ZEISS Imager.A2顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)特征觀察及拍照。將線蟲液收集到離心管中，用4%甲醛殺死固定后，采用甘油－乙醇快速脫水法[2]對(duì)線蟲進(jìn)行脫水并制作永久玻片，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)特征觀察及拍照，利用de Man公式進(jìn)行形態(tài)測(cè)計(jì)[3]。 包括體長(zhǎng)、體長(zhǎng)/最大體寬（a）、體長(zhǎng)/頭頂至食道腺和腸連接處距離（b）、體長(zhǎng)/頭頂至食道腺末端距離（b′）、體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)（c）、尾長(zhǎng)/肛門處體寬或泄殖腔處體寬（c′）、頭頂至陰門處距離/體長(zhǎng)（V）、口針長(zhǎng)度、尾長(zhǎng)和交合刺長(zhǎng)度等指標(biāo)。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

挑取單條線蟲放入ddH2O中清洗，去除表面雜質(zhì)。用單條線蟲DNA快速提取試劑盒（百川生物）提取線蟲基因組DNA，獲取DNA提取液直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。核糖體DNA（rDNA）的28S D2/D3區(qū)擴(kuò)增引物對(duì)為 D2A（5′－ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG－3′）和 D3B（5′－TCGGAAGGAACCAGCTACTA－3′）[4]，由南京金斯瑞合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為線蟲DNA模板 1 μL、5 μmol/L 的上游引物和下游引物各 2 μL、2×Ex Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL。 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 30 s，54℃退火 40 s，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京思普金生物科技有限公司測(cè)序，所獲得拼接序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 洞穴長(zhǎng)尾線蟲

分類地位：真滑刃總科（Aphelenchoidea）滑刃科（Aphelenchoididae）長(zhǎng)尾亞科（Seinurinae）長(zhǎng)尾屬（Seinura）[5]。

2.1.1 形態(tài)特征描述。雌蟲形態(tài)特征如圖1所示：熱殺死后，洞穴長(zhǎng)尾線蟲雌蟲向腹面彎曲，頭部較高，縊縮明顯，口針纖細(xì)，無口針基部球，基部稍膨大；食道前體部長(zhǎng)筒形，中食道球發(fā)達(dá)，長(zhǎng)橢圓形，近體寬，瓣門明顯，位于中食道球中后部；排泄孔位于中食道球基部前方；食道腺長(zhǎng)葉狀，從背面覆蓋腸；陰門位于蟲體中后部，橫裂，陰道稍向前傾斜；單生殖腺，卵巢前伸，有后陰子宮囊；肛門明顯，尾部較長(zhǎng)，絲狀。雄蟲未見。

測(cè)計(jì)值及文獻(xiàn)比較見表1。與Kanzaki等[6]的描述值相比較，本文雌蟲的體長(zhǎng)及尾長(zhǎng)均略短，分別為（746.1±19.9）μm（變化范圍為 726.0～772.1 μm）、（102.5±7.8）μm（變化范圍為 95.1～113.2 μm）；其他測(cè)計(jì)值基本相符。

表1 洞穴長(zhǎng)尾線蟲測(cè)計(jì)值及文獻(xiàn)比較

2.1.2 分子生物學(xué)特征分析。PCR擴(kuò)增獲得一條長(zhǎng)度為756 bp的28S D2/D3區(qū)DNA序列。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該序列與GenBank中已登錄的S.caverna（LC414971）序列相似性達(dá)100%。

2.2 毀芽滑刃線蟲

分類地位：真滑刃總科（Aphelenchoidea）滑刃科（Aphelenchoididae）滑 刃 亞 科 （Aphelenchoidinae）滑刃屬（Aphelenchoides）[5]。

2.2.1 形態(tài)特征描述。如圖2所示：雌蟲熱殺死后向腹面彎曲，體表具環(huán)紋，側(cè)線4條；唇區(qū)縊縮明顯，唇區(qū)寬約為唇高2倍；口針長(zhǎng)約13 μm，基部球明顯；中食道球卵圓形，肌肉組織發(fā)達(dá)，近體寬，瓣門骨化明顯，新月形；食道峽部短，神經(jīng)環(huán)位于中食道球后約1個(gè)中食道球長(zhǎng)度位置；食道腺葉狀，背面覆蓋腸端；單卵巢，前伸，卵母細(xì)胞單列，有后陰子宮囊，長(zhǎng)度為肛陰距的1/2～2/3；陰門位于蟲體中后部，V值約為68%；尾圓錐形，尾長(zhǎng)約為肛門處體寬的3倍，尾端具單尾尖突。雄蟲形態(tài)特征與雌蟲相似，但體長(zhǎng)普遍比雌蟲短；交合刺呈玫瑰刺狀，具基頂和喙突；無引帶和交合傘；尾形與雌蟲相似，具單尾尖突。

測(cè)計(jì)值及文獻(xiàn)比較見表2和表3。與Consoli等[7]和Franklin等[8]的描述值相比較，本文雌蟲a值較小，為 25.4±0.9（變化范圍為 24.2～26.4），陰門位置略靠前，V 值為 67.9%±0.9%（變化范圍為 66.8%～69.0%），其他測(cè)計(jì)值基本相符。本文雄蟲體長(zhǎng)略高于Consoli等[7]的描述值，低于Franklin等[8]的描述值，體長(zhǎng)為（689.0±65.6）μm（變化范圍為 606.3～771.2 μm）；a值、口針及交合刺長(zhǎng)度與Consoli等[7]的描述相似，均低于Franklin等[8]的描述值；其他測(cè)計(jì)值基本相符。

表2 毀芽滑刃線蟲雌蟲測(cè)計(jì)值及文獻(xiàn)比較

表3 毀芽滑刃線蟲雄蟲測(cè)計(jì)值及文獻(xiàn)比較

2.2.2 分子生物學(xué)特征分析。提取雌蟲DNA，PCR擴(kuò)增獲得一條長(zhǎng)度為733 bp的28S D2/D3區(qū)DNA序列，BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該序列與GenBank中已登錄的A.blastophthorus（MK981894）序列相似性達(dá)98%。

2.3 燕麥真滑刃線蟲

分類地位：真滑刃總科（Aphelenchoidea）真滑刃科（Aphelenchidae）真滑刃亞科（Aphelenchinae）真滑刃屬（Aphelenchus）[5]。

2.3.1 形態(tài)特征描述。雌蟲形態(tài)特征如圖3所示：熱殺死后稍向腹面彎曲，頭部低平，口針較細(xì)，無基部球；中食道球大、近方形，直徑近體寬，食道球瓣門發(fā)達(dá)，食道峽部較短；食道腺葉狀，從背面覆蓋腸端；雌蟲陰門位置較后，陰門橫裂，陰門唇有時(shí)略突起，單生殖腺，卵巢前伸，后陰子宮囊長(zhǎng)度超過肛陰距的1/2；肛門前唇略突起；尾短，稍向腹面彎曲，末端鈍圓或?qū)拡A。雄蟲未見。測(cè)計(jì)值及文獻(xiàn)比較見表4，與Goodey等[9]和李星月等[10]的描述值相比較，本文雌蟲陰門位置略靠后，頭至陰門距離/體長(zhǎng)V值為77.1%±1.6%（變化范圍為 74.6%～78.8%）；且尾長(zhǎng)略短，尾長(zhǎng)為（24.0±4.02）μm（變化范圍為 18.9～33.5 μm）；其他測(cè)計(jì)值基本相符。

表4 燕麥真滑刃線蟲雌蟲測(cè)計(jì)值及文獻(xiàn)比較

2.3.2 分子生物學(xué)特征分析。PCR擴(kuò)增獲得一條長(zhǎng)度為707 bp的28S D2/D3區(qū)DNA序列，BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該序列與GenBank中已登錄的A.avenae（KP313838）序列同源性達(dá)98%。

3 結(jié)論與討論

隨著外來花卉種球進(jìn)境的線蟲種類繁多，口岸人員關(guān)注檢疫性植物寄生線蟲的同時(shí)，也面臨著數(shù)量及種類更為龐大的非檢疫性線蟲檢疫，此類線蟲的潛在性危險(xiǎn)不容忽視。因此，準(zhǔn)確判斷線蟲種類，對(duì)提高口岸線蟲檢疫水平、加強(qiáng)口岸進(jìn)境花卉種球風(fēng)險(xiǎn)分析至關(guān)重要。近年來，隨著實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的提升，連云港口岸截獲線蟲種類及數(shù)量明顯上升，本文所描述3種線蟲均為江蘇口岸首次截獲。

長(zhǎng)尾屬線蟲廣泛分布于世界各地，是一類食性較廣的捕食性線蟲，主要存在于土壤中，具有維持土壤線蟲種群動(dòng)態(tài)平衡的作用，在枯死的松樹中也常被發(fā)現(xiàn)[11]。長(zhǎng)尾線蟲屬是一類形態(tài)學(xué)研究還不太完善的類群，在迄今已報(bào)道的44個(gè)有效種中，絕大部分種類仍然存在特征描述不完善的問題[12]。洞穴長(zhǎng)尾線蟲（S.caverna）在連云港口岸進(jìn)境百合種球檢疫中多次截獲，主要存在于百合種球隨附的介質(zhì)土中，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道對(duì)洞穴長(zhǎng)尾線蟲的研究較少，其形態(tài)特征描述有待完善，有無致病性也有待進(jìn)一步研究。

我國(guó)對(duì)外公布的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，滑刃屬線蟲只有草莓滑刃線蟲（Aphelenchoides fragariae）、菊花滑刃線蟲（Aphelenchoides ritzemabosi）。 毀芽滑刃線蟲（A.blastophthorus）最早在英國(guó)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道較少。有研究表明，毀芽滑刃線蟲能夠引起山蘿卜屬植物葉片卷曲、花序減少，對(duì)草莓也具有潛在破壞力[8]。因此，在進(jìn)境線蟲檢疫中應(yīng)給予足夠重視。

燕麥真滑刃線蟲（A.avenae）在世界各地均有分布，美國(guó)、法國(guó)、中國(guó)、意大利、印度、加拿大、菲律賓等國(guó)都有報(bào)道，是一類食真菌線蟲，也可取食植物，寄主范圍十分廣泛[13]。有研究表明，燕麥真滑刃線蟲對(duì)土壤氮礦化、植物生長(zhǎng)及真菌生長(zhǎng)有影響，但其作用與土壤生態(tài)系統(tǒng)存在復(fù)雜的相互關(guān)系[14]。燕麥真滑刃線蟲在進(jìn)境百合種球檢疫中頻繁截獲，對(duì)種球生長(zhǎng)有無不利影響有待進(jìn)一步研究。