半夏-附子藥對拮抗冠心病分子機制研究*

楊杰 彭啟倫 郭步伐 丁維俊

(1.畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)系，貴州 畢節(jié) 551700；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075)

半夏與附子同方配伍一直以來頗受眾多醫(yī)家的爭議，源于附子來自烏頭的側(cè)根，隨后形成了附子反半夏這一假說；同時，《中華人民共和國藥典2020版》中指出附子不應(yīng)與半夏相配伍。然而，半夏附子同方配伍見于眾多古方之中，如出自《扁鵲心書神方》的附子半夏湯，以及見于《傷寒雜病倫》的小青龍湯、附子梗米湯和竹葉湯[1-2]。李筠等[3]收集文獻1295篇，涉及患者30042例，發(fā)現(xiàn)半夏附子同方配伍主要用于治療咳喘、胸痹、胃炎胃痛等疾病。李玲等[4]研究結(jié)果表明，附子與半夏配伍可能通過抗自由基和減少細胞凋亡，對心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。

胸痹屬于中醫(yī)病名，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)冠心病有異曲同工之妙，其主要病機為心脾肝腎虧虛，兼有寒凝、氣滯、血瘀和痰阻，乃至心脈失養(yǎng)所致?！渡颀埍静萁?jīng)》中記載附子、半夏為“下品”之藥，但卻應(yīng)用廣泛?！侗菊聟R言》曰：“附子辛溫大熱，其性善走，為通十二經(jīng)純陽之要藥，外則達皮毛而除表寒，里則達下元而溫痼冷，徹內(nèi)徹外，凡三焦經(jīng)絡(luò)，諸臟諸腑，果有真寒，無不可治。”半夏味辛性溫而燥，為燥濕化痰，溫化寒痰之要藥。兩藥性味相似，配伍用藥，辛溫化痰消瘀而除胸痹，共奏減毒增效之功。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為系統(tǒng)生物學(xué)的一門分支學(xué)科，可闡釋中藥及復(fù)方調(diào)控疾病靶點、信號通路的整體網(wǎng)絡(luò)，在中醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[5-7]。周思思等[8-9]通過UPLC/Q-TOF-MS建立半夏附子配伍后水煎液生物堿成分的化學(xué)指紋圖譜，并分析其差異變化顯著的化學(xué)成分。楊欣等[10]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲取8個半夏-附子藥對關(guān)鍵活性成分，并篩選了磷脂酰肌醇三激酶α(PI3Kα)，類脂磷酸酶(PTEN)，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)等抗腫瘤關(guān)鍵靶標蛋白。但是從半夏-附子藥對角度切入研究冠心病仍是十分缺乏的。因此，我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法探究半夏-附子藥對拮抗冠心病的分子機制。

1 材料與方法

1.1半夏-附子藥對活性成分篩選 在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)收集半夏、附子的化學(xué)成分。以口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)為標準建立半夏-附子藥對的化學(xué)成分集，并在TCMSP中查詢各自化學(xué)成分的相應(yīng)靶點。將上述所收集到的靶點在UniProt數(shù)據(jù)庫中查詢基因名，選擇的物種為人，以靶基因的縮寫表示。

1.2收集疾病相關(guān)靶點 以coronary heart disease為關(guān)鍵詞在DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中搜索冠心病相關(guān)靶點，然后通過R3.6.2軟件將半夏-附子藥對活性成分的靶點與冠心病相關(guān)靶點繪制韋恩圖并取交集，得到共同的靶點。

1.3構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò)) 將上述分析得到的共同靶點導(dǎo)入STRING(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人，得到了半夏-附子藥對治療冠心病的PPI網(wǎng)絡(luò)。通過R3.6.2軟件將其得到的“TSV”文件進行柱狀圖分析，計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點自由度(degree)值，degree值越大表示節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的核心地位。

1.4GO與KEGG富集分析 使用R3.6.2軟件對半夏-附子藥對拮抗冠心病的靶點進行GO與KEGG富集分析，選擇物種為人，篩選出P<0.05的生物學(xué)過程與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并根據(jù)富集P值的顯著性進行排序，將富集P值前20位的通路以柱狀圖的形式進行展示。

1.5構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)并分析 Cytoscape3.7.1是中藥及復(fù)方網(wǎng)絡(luò)的可視化分析軟件。輸入半夏-附子藥對活性成分以及半夏-附子藥對拮抗冠心病的相關(guān)靶點，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)。同時，導(dǎo)入KEGG富集信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.6分子對接驗證 選取PPI網(wǎng)絡(luò)degree值排名前6位的靶點以及富集8條以上KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶點與對應(yīng)活性成分進行分子對接。在PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載化合物2D結(jié)構(gòu)的“.sdf ”格式文件，并通過Chem3D軟件轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)“.mol2”格式文件。在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中下載靶點的3D結(jié)構(gòu)“.pdb ”格式文件，并經(jīng)PyMOL軟件去除水分子和小分子配體。在AutoDockTools 1.5.6軟件中導(dǎo)入靶點的3D結(jié)構(gòu)，經(jīng)加氫、分配電荷等輸出“.pdbqt”格式文件，然后輸入活性成分“.mol2”格式文件，并輸出活性成分“.pdbqt”格式文件，運行Grid模塊設(shè)置蛋白原配體對接的活性口袋；最后運行AutoDock_vina 1.1.2分子模擬軟件進行分子對接，用結(jié)合能評價化合物與受體的匹配情況，采用PyMOL軟件繪制最佳匹配結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1半夏-附子藥對活性成分的篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中，獲取半夏化學(xué)成分116個，附子化學(xué)成分65個。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件篩選到半夏化學(xué)成分13個，附子化學(xué)成分21個。通過TCMCP數(shù)據(jù)庫檢索，11個半夏化學(xué)成分和6個附子化學(xué)成分均查詢到相應(yīng)的靶點。17個化合物的代碼、分子名以及相應(yīng)的口服生物利用度、類藥性和相應(yīng)靶點數(shù)值見表1。

2.2半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病相關(guān)靶點的篩選 在DisGeNET、OMIM中以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞搜索冠心病相關(guān)靶點1679個，并與半夏-附子藥對活性成分相關(guān)靶點取交集，得到其共同靶點35個。這些靶點在半夏-附子藥對抗冠心病的過程中發(fā)揮著一定的作用。

2.3構(gòu)建并分析半夏-附子藥對治療冠心病相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) 將上述35個共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過R語言制作柱狀圖，展示degree值較高的前30位，見圖1。尤其是degree值排名前6位的靶點：AKT1(RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)、FOS(原癌基因)、VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)、MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)、PPARG(過氧化物酶體增生物激活受體γ)和PTGS2(前列腺素合成酶2)。

表1 半夏-附子藥對活性成分表

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值前30位的靶點

2.4GO生物學(xué)過程富集與KEGG通路富集分析 通過R語言對半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病的35個相關(guān)靶點進行GO生物學(xué)過程富集分析，結(jié)果顯示35個靶點共在57個GO term上富集。圖2展示了富集P值較顯著的前20位生物學(xué)過程，如腎上腺素受體活性(adrenergic receptor activity)、細胞核受體活性(nuclear receptor activity)、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)、兒茶酚胺結(jié)合(catecholamine binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)等。

對半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病的35個靶點進行KEGG富集分析，結(jié)果顯示35個靶點共富集在75條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。圖3展示了富集P值較顯著的前20位KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)通路富集P值最顯著，此通路參與的靶點有9個，在所有信號通路里靶點存在的數(shù)量最高，分別為RXRA(視黃酸受體RXR-α)、RELA(轉(zhuǎn)錄因子p65)、AKT1(RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)、BCL2(細胞凋亡調(diào)控因子)、FOS(原癌基因)、BAX(細胞凋亡調(diào)控因子)、MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)、NFATC1(活化T細胞的核因子)和PPARG(過氧化物酶體增生物激活受體γ)。同時，脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路所參與AKT1、FOS、MMP9和PPARG等4個靶點與PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前6位的靶點相吻合，提示了此4個靶點在半夏-附子藥對抗冠心病中的重要性。

圖2 GO富集分析

2.5構(gòu)建并分析“半夏-附子藥對活性成分-冠心病-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò) 將半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病的35個靶點輸入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“半夏-附子藥對活性成分-冠心病-靶點”網(wǎng)絡(luò)(見圖4)，此網(wǎng)絡(luò)圖共包含53個節(jié)點(一個半夏-附子藥對、一種疾病、35個靶基因、16個活性成分)和187條邊；將KEGG富集通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)(見圖5)，由富集P值較顯著的前20條信號通路與24個靶點組成，其中AKT1富集18條KEGG信號通路，RELA(15)，F(xiàn)OS(12)，MMP9(10)，NFATC1(8)。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)degree值排名前6位的靶點進行分析，半夏-附子藥對與上述靶點相對應(yīng)的化合物為baicalein(MOL002714)、coniferin(MOL000519)、Cavidine (MOL002670)、beta-sitosterol(MOL000358)、Stigmasterol (MOL000449)、Deltoin(MOL002392)、Deoxyandrographolide (MOL002395)、Karanjin(MOL002398)、xanthine-9 (MOL006967)等，相應(yīng)靶點為AKT1、RELA、FOS、MMP9、NFATC1、VEGFA、PPARG、PTGS2等，主要涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。

圖3 KEGG富集分析

圖4 半夏-附子藥對活性成分-冠心病-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖5 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6分子對接結(jié)果 一般認為，分子對接結(jié)合能的絕對值越大，化合物與靶點的結(jié)合力越強，構(gòu)象也就越穩(wěn)定。某研究表明，結(jié)合能絕對值大于5，提示結(jié)合能力較高[11-12]；結(jié)合能絕對值大于7時，提示結(jié)合能力高[6]。表2中所有分子對接結(jié)合能絕對值均大于5，尤其是baicalein(AKT1)、baicalein(FOS)、baicalein(MMP9)、baicalein(PTGS2)、cavidine(PTGS2)和deltoin(PTGS2)分子對接結(jié)合能絕對值大于9。同時，AKT1、FOS、MMP9和PTGS2靶點與PPI網(wǎng)絡(luò)degree值排名前6位的靶點相一致。綜上分析，baicalein、cavidine和deltoin可能是半夏-附子藥對抗冠心病的關(guān)鍵成分。

表2 半夏-附子藥對活性成分與冠心病相關(guān)靶點的分子對接結(jié)果

圖6 分子對接模擬圖

3 討論

經(jīng)數(shù)字信息挖掘，半夏與附子中16個活性成分調(diào)控35個冠心病相關(guān)靶點，涉及75條生物學(xué)過程，體現(xiàn)半夏-附子同方配伍抗冠心病的多組分、多靶點和多通路的特點。PPI網(wǎng)絡(luò)柱狀圖分析提示了半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病的核心靶點，其蛋白產(chǎn)物涉及炎癥、脂質(zhì)代謝、血管內(nèi)皮調(diào)控等重要生理生化過程。因剪切應(yīng)力和血流量的影響，AKT1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在血管內(nèi)的活性將被來自血液的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)所激活[13-14]；同時，活化的ATK1將激活血管內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOS)，進一步生成一氧化氮(NO)，并促進血管擴張和增強血流量[13-14]。PPARG(過氧化物酶體增生物激活受體γ)的下游信號可產(chǎn)生脂聯(lián)素，減少脂肪組織炎癥，并改善胰島素抵抗，緩解動脈粥樣硬化病變[15-17]。已有研究表明，MMP9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)和PTGS2(前列腺素合成酶2)為炎癥基因，其血清中水平的升高可增加缺血性中風(fēng)急性事件的發(fā)生，惡化加重冠心病發(fā)生的進程[18-25]?？傊?，以上靶點，炎癥基因與抗炎癥基因共存，半夏-附子藥對活性成分通過協(xié)調(diào)其平衡而改善冠心病患者的預(yù)后，從而很大程度上減少其致死率。

KEGG通路富集分析所得到的信號通路大多數(shù)與炎癥過程、脂質(zhì)代謝和動脈粥樣硬化相關(guān)。由圖3可知，脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)[26-28]通路富集P值最顯著，可認為是半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在此通路中，低密度脂蛋白(LDL)通過血管內(nèi)膜形成輕微氧化修飾的LDL(mmLDL)，再進一步氧化修飾成oxLDL，并被攝取入巨噬細胞，然后吞噬大量脂滴并形成泡沫細胞，進而誘導(dǎo)血管平滑肌細胞增生、遷移，導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的形成。同時、細胞壞死、凋亡將促進不穩(wěn)定性斑塊形成。其中，BCL-2[29-30]、BAX[31-32]和FOS[33-34]是參與細胞凋亡生物學(xué)過程的關(guān)鍵基因。經(jīng)“靶點-通絡(luò)”網(wǎng)絡(luò)分析，AKT1、RELA[35-37]、FOS、MMP9和NFATC1[38-41]靶點所參與KEGG信號通絡(luò)數(shù)量較多，而AKT1、FOS和MMP9為PPI網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前6位的靶點，可認為是半夏-附子藥對活性成分拮抗冠心病的關(guān)鍵靶點。

經(jīng)過PPI網(wǎng)絡(luò)、藥物-成分-靶點-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)和分子對接分析，半夏-附子藥對活性成分所調(diào)控的關(guān)鍵冠心病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路；根據(jù)分子對接結(jié)合能絕對值大于9，我們認為半夏-附子藥對拮抗冠心病的關(guān)鍵有效成分為baicalein、cavidine和deltoin，其調(diào)控的關(guān)鍵靶點為AKT1、FOS、MMP9和PGTS2。但是，后期還需要通過實驗進一步進行驗證。