GeneXpert MTB/RIF陽性RNA聚合酶β亞基基因突變的結(jié)核病患者中利福平耐藥決定區(qū)突變特征研究

孫晴 廖鑫磊 王晨倩 姜廣路 董玲玲 王芬 趙立平 黃海榮 王桂榮

利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)通常是由編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變引起，且突變主要集中在一個(gè)長為81 bp 的利福平耐藥決定區(qū)(rifampicin resistance determining region, RRDR)。有研究表明，約95%的RR-TB存在rpoB基因RRDR突變[1-2]。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)技術(shù)是一種以PCR原理為基礎(chǔ)的體外診斷技術(shù)，僅需2 h即可報(bào)告MTB檢出情況，并同時(shí)報(bào)告利福平耐藥相關(guān)基因rpoB的突變情況[3]。WHO在2010年推薦Xpert用于肺結(jié)核的診斷，2013年推薦其用于肺外結(jié)核及兒童結(jié)核病的診斷[4-5]。Xpert通過5條重疊覆蓋rpoB基因RRDR的探針來檢測利福平耐藥，rpoB基因RRDR共編碼27個(gè)氨基酸(507～533位點(diǎn))，探針A覆蓋氨基酸507～511位點(diǎn)、探針B覆蓋氨基酸512～518位點(diǎn)、探針C覆蓋氨基酸518～523位點(diǎn)、探針D覆蓋氨基酸523～529位點(diǎn)及探針E覆蓋氨基酸529～533位點(diǎn)[6-7]。rpoB基因突變位點(diǎn)常具有地域特點(diǎn)，不同國家、地區(qū)報(bào)道的rpoB基因突變位點(diǎn)存在差異。此外，rpoB基因的不同突變位點(diǎn)與MTB對(duì)利福平耐藥水平的高低有關(guān)，如531及526位點(diǎn)突變與利福平高水平耐藥相關(guān)[8]。

對(duì)利福平耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)的研究有利于監(jiān)測突變位點(diǎn)的變化規(guī)律，本研究通過分析Xpert陽性結(jié)核病患者中rpoB基因探針的突變分布與頻率，闡明rpoB基因突變特征，為進(jìn)一步分析和研究我國RR-TB耐藥基因突變位點(diǎn)提供依據(jù)。

對(duì)象和方法

一、 研究對(duì)象

連續(xù)納入2019年6月至2020年6月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院的Xpert檢測陽性且rpoB基因突變的682例結(jié)核病患者。肺結(jié)核618例，男413例，女205例，中位年齡42歲，年齡范圍14～91歲；其中痰液標(biāo)本465份，支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本153份。肺外結(jié)核64例，男38例，女26例，中位年齡40歲，年齡范圍13～84歲；其中膿液標(biāo)本37份(骨關(guān)節(jié)結(jié)核)，胸腔積液標(biāo)本19份(結(jié)核性胸膜炎)，便標(biāo)本7份(腸結(jié)核)，腦脊液標(biāo)本1份(結(jié)核性腦膜炎)，見表1。

表1 682例結(jié)核病患者的一般情況 [例(構(gòu)成比，%)]

二、 標(biāo)本分組

682份標(biāo)本均進(jìn)行了Xpert檢測，其中603份標(biāo)本進(jìn)行了抗酸桿菌染色鏡檢。將所收集的標(biāo)本根據(jù)類型分為肺結(jié)核標(biāo)本與肺外結(jié)核標(biāo)本；根據(jù)涂片檢查結(jié)果分為涂片陰性，涂片陽性(+、++、+++、++++)。

三、研究方法

1.Xpert：嚴(yán)格按照試劑盒的說明書(美國Cepheid公司)處理標(biāo)本。1 ml標(biāo)本預(yù)先加2倍體積的標(biāo)本消化液處理后，渦旋振蕩至少10 s，直至無塊狀的標(biāo)本存在。室溫下靜置15 min，等待標(biāo)本充分液化。用無菌吸管吸取2 ml處理好的標(biāo)本液于反應(yīng)盒內(nèi)，置于GeneXpert系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)檢測。Xpert結(jié)果顯示為：MTB檢出或未檢出，同時(shí)顯示利福平的耐藥結(jié)果，即rpoB基因5條探針突變檢測結(jié)果。Xpert通過半定量分析標(biāo)本中MTB負(fù)荷量，根據(jù)循環(huán)閾值(Ct)由低到高將MTB含量的半定量水平劃分為高、中、低、極低4個(gè)等級(jí)。Ct值>28為極低、22～28為低、16～22為中，<16為高[9]。

2.抗酸桿菌染色鏡檢：所有標(biāo)本均進(jìn)行涂片熒光染色，在顯微鏡下觀察，報(bào)告方式：20倍物鏡按+～++++進(jìn)行分級(jí)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以“百分率或構(gòu)成比(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Xpert陽性標(biāo)本中MTB含量的半定量結(jié)果

682份Xpert陽性且rpoB基因突變的標(biāo)本中，MTB半定量水平為高占6.45%(44/682)，中占25.07%(171/682)，低占25.51%(174/682)，極低占42.97%(293/682)。肺結(jié)核標(biāo)本中MTB檢出高、中水平均高于肺外結(jié)核標(biāo)本，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，肺結(jié)核標(biāo)本中MTB檢出極低水平低于肺外結(jié)核標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同Xpert陽性rpoB基因突變標(biāo)本中MTB的含量在不同患者中的分布情況

二、Xpert 陽性MTB半定量水平與涂片陽性的相關(guān)性

682份標(biāo)本中603份(88.42%)進(jìn)行了抗酸桿菌染色鏡檢，其中211份(34.99%)陽性，392份(65.01%)陰性。標(biāo)本涂陽率在MTB半定量為高、中、低和極低水平中分別占84.62%(33/39)、64.02%(105/164)、27.27%(42/154)和7.84%(20/255)，Xpert陽性MTB半定量結(jié)果高和中水平的標(biāo)本中涂片陽性率較高，見表3。

表3 Xpert 陽性標(biāo)本MTB半定量結(jié)果與涂片陽性的相關(guān)性

三、Xpert陽性rpoB基因探針的突變分布與頻率

682份標(biāo)本中，633份(92.82%)檢測到單探針突變，47份(6.89%)檢測到雙探針突變，2份(0.29%)檢測到三探針突變。單探針突變頻率最高的為探針E(74.34%，507/682)，其次為探針D(8.80%，60/682)；雙探針突變頻率最高的為探針D+E(4.25%，29/682)，其次為探針A+B(1.76%，12/682)；2例三探針突變?yōu)樘结楢+D+E。rpoB基因探針的突變分布與頻率在肺結(jié)核和肺外結(jié)核標(biāo)本間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 682份標(biāo)本 rpoB基因探針突變的分布情況

49份多重探針突變標(biāo)本中，僅有25份為住院患者，具有詳細(xì)的病史信息，25例患者中 11例具有結(jié)核病病史。

討 論

本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核標(biāo)本中MTB檢出高、中水平均明顯高于肺外結(jié)核標(biāo)本，而肺結(jié)核標(biāo)本中MTB檢出極低水平明顯低于肺外結(jié)核標(biāo)本。該結(jié)果說明肺外結(jié)核標(biāo)本中MTB含量明顯低于肺結(jié)核標(biāo)本。另外，Xpert陽性標(biāo)本中MTB半定量水平越高，標(biāo)本涂片陽性率也越高。 Blakemore等[10]的研究顯示，痰標(biāo)本MTB檢出多集中于高、中檢出水平，且涂片菌量越高，其處于高檢出水平的標(biāo)本越多，這與本研究的結(jié)果相似。

本研究中含64份Xpert陽性的肺外結(jié)核標(biāo)本，但僅有1份涂片鏡檢結(jié)果為陽性。涂片鏡檢的最低檢出限約為1000 CFU/ml，Xpert技術(shù)的最低檢出限為112.6 CFU/ml，因此，會(huì)有一部分結(jié)核病患者標(biāo)本的檢測結(jié)果為Xpert陽性涂片陰性[11-12]。臨床上經(jīng)常使用抗酸桿菌染色鏡檢技術(shù)進(jìn)行初篩，但由于肺外結(jié)核標(biāo)本中MTB的含量較低，涂片陽性率較低，而Xpert檢測的敏感度高、最低檢出限低，對(duì)于提高含菌量低的肺外結(jié)核的病原學(xué)診斷水平具有重要價(jià)值。

Xpert通過5條重疊覆蓋rpoB基因81 bp、27個(gè)氨基酸的RRDR的探針來檢測利福平耐藥，而不同的突變位點(diǎn)被認(rèn)為與利福平耐藥水平的高低有關(guān)。Zeka等[13]認(rèn)為S531L、H526D、D516 V的突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)利福平的高水平耐藥；D516Y、M515I、Q510H突變對(duì)利福平低水平耐藥相關(guān)；S512I和D516G的雙重突變對(duì)利福平低水平耐藥相關(guān)。本研究分析了682例Xpert陽性結(jié)核病患者rpoB基因探針的突變分布與頻率，其中突變率最高的為探針E(位點(diǎn)529～533，74.34%)和探針D(位點(diǎn)523～529，8.80%)，兩者突變率之和為83.14%。Ullah等[14]的研究結(jié)果顯示，在巴基斯坦探針突變頻率最高的為探針E(76.96%，314/408)，這與本研究結(jié)果相似。但是，在巴基斯坦探針B的突變頻率(10.78%，44/408)要高于探針D(8.33%，34/408)、探針C突變頻率(1.47%，6/408)要高于探針A(1.23%，5/408)，這與本研究結(jié)果有所差異。而埃塞俄比亞的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，突變頻率最高的為探針E(81.0%)，其次是探針D(10.0%)及探針B(3.0%)，未發(fā)現(xiàn)探針A和探針C突變，這一研究結(jié)果與本研究的結(jié)果較為相似[3]。Uddin等[7]的研究顯示，在孟加拉國探針E突變頻率最高(64.88%，133/205)，其次為探針B(15.12%，31/205)、探針D(12.20%，25/205)、探針A(2.93%，6/205)及探針C(2.44%，5/205)。在我國，李麗等[15]的研究顯示531位點(diǎn)(52.49%)是我國最常見的rpoB基因突變位點(diǎn)，其次為526位點(diǎn)(24.66%)、516位點(diǎn)(9.26%)、511位點(diǎn)(3.76%)及533位點(diǎn)(3.45%)，也較為常見。其中531位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針E、526位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針D、516位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針B、511位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針A、533位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針E，這與本研究的結(jié)果相似?？梢姡M管地區(qū)不同，rpoB基因突變多集中于探針E、D和B，占突變的86%～94%。探針E、D和B分別對(duì)應(yīng)著rpoB基因531、526和516這3個(gè)利福平高水平耐藥位點(diǎn)，因此以上3個(gè)位點(diǎn)是結(jié)核病患者利福平耐藥的分子診斷重點(diǎn)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)rpoB基因531、526和516位點(diǎn)突變也與利福布汀耐藥有關(guān)，了解rpoB基因的具體突變位點(diǎn)對(duì)合理使用利福霉素類藥物具有臨床提示意義[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)49份標(biāo)本存在多重探針突變，包含探針A+B突變、探針A+C突變、探針A+D突變、探針A+D+E突變、探針B+C突變、探針B+D突變及探針D+E突變。Uddin等[7]及Ullah等[14]的研究認(rèn)為，多重探針突變與患者之前有結(jié)核病病史并進(jìn)行過治療有關(guān)，Ullah等發(fā)現(xiàn)的5例多重探針突變(1例探針A+B突變、3例探針B+D突變、1例探針D+E突變)及Uddin等發(fā)現(xiàn)的5例多重探針突變(1例探針A+B突變、2例探針A+D突變、1例探針A+E突變、1例探針B+E突變)僅出現(xiàn)于之前有結(jié)核病病史并進(jìn)行過治療的患者中。Bahrmand等[17]的研究認(rèn)為多重探針突變多發(fā)生于繼發(fā)性感染的患者中，而且該523位點(diǎn)、531位點(diǎn)和526位點(diǎn)的多重突變組合，對(duì)利福平具有更高耐藥性(MIC>100 μg/ml)。胡族瓊等[18]也認(rèn)為，多重密碼子突變株的利福平耐藥水平明顯高于單密碼子突變株。本研究中49例多重探針突變標(biāo)本中，僅有25例為住院患者且具有詳細(xì)的病史信息，25例患者中有11例具有結(jié)核病病史。多重探針突變是由既往結(jié)核病還是由繼發(fā)感染引起，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，Xpert陽性rpoB基因突變標(biāo)本中以單探針突變?yōu)橹?，突變頻率最高的為探針E和探針D，rpoB基因探針的突變分布與頻率在肺結(jié)核和肺外結(jié)核中差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究的不足在于本研究為回顧性研究，患者標(biāo)本無留存，無法對(duì)rpoB基因測序至準(zhǔn)確的突變位點(diǎn)，有一定的局限性。此外，部分患者為門診患者，無法采集完整的病史信息，多重探針突變與結(jié)核病病史的關(guān)聯(lián)性還需進(jìn)一步的探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)孫晴：采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫和修改；廖鑫磊、王晨倩和姜廣路：數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析；董玲玲、王芬和趙立平：采集數(shù)據(jù)；黃海榮：獲取科研經(jīng)費(fèi)和行政、技術(shù)或材料支持；王桂榮：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析、文章修改和指導(dǎo)