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    窄葉藍(lán)盆花種子生活力檢驗(yàn)方法比較*

    2022-04-07 02:54:02呂麗娟張曉明穆贏通樊東昌王俊杰
    草原與草業(yè) 2022年1期
    關(guān)鍵詞:紅墨水熒光法盆花

    呂麗娟,張曉明,穆贏通,樊東昌,王俊杰

    (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院,呼和浩特 010018)

    蒙藥材藍(lán)盆花是川續(xù)斷科藍(lán)盆花屬,華北藍(lán)盆花(ScabiosatschiliensisGrunning.)和窄葉藍(lán)盆花(ScabiosacomosaFisch. ex Roem. et Schult.)的干燥花序,蒙藥名為套森-套日麻,性味澀、甘、鈍、膩、燥、重、涼;具有清熱、清“協(xié)日”瀉火的功效,臨床常用基礎(chǔ)藥物來治療多種疾病,主要用于治肺熱、肝熱、咽喉熱等疾病[1-3]。通常所用藥源采自野生植株。由于環(huán)境破壞導(dǎo)致資源緊缺,近幾年開始采用種子繁殖人工種植途徑。但市場上藍(lán)盆花種子(瘦果)胚發(fā)育不良,質(zhì)量參差不齊,嚴(yán)重限制了藍(lán)盆花的大規(guī)模種植。針對以上問題需制定藍(lán)盆花種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn),確保種子質(zhì)量是種植藍(lán)盆花的關(guān)鍵問題之一。種子生活力是種子質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)之一[4],目前測定生活力的常見方法有TTC法、紅墨水法、BTB法和紙上熒光法等。其中,TTC法是目前國際上常用的方法,大部分植物都采用此方法,如油桐[5]、黃芪[6]、滇重樓[7];熒光法主要用于含有熒光物質(zhì)的種子,如白菜、甘藍(lán)[8];鎖陽[9]、山豆根[10]常采用溴麝香草酚藍(lán)(BTB)法;紅墨水法測定種子生活力采用較少。本試驗(yàn)采用4種方法對窄葉藍(lán)盆花種子生活力進(jìn)行測定,以期找到藍(lán)盆花種子生活力測定的最佳方法,并對最佳方法進(jìn)行優(yōu)化,為藍(lán)盆花種子質(zhì)量分級提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)材料采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正鑲藍(lán)旗、呼倫貝爾市陳巴爾虎旗、呼和浩特市武川縣人工種植收獲的窄葉藍(lán)盆花種子,收獲后在4℃低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1發(fā)芽率測定

    在清選好的窄葉藍(lán)盆花凈種子中,隨機(jī)各挑選300粒,每重復(fù)100粒,3次重復(fù),用75%對的酒精消毒45 s,用清水3次沖洗,放置于2層定性濾紙的培養(yǎng)皿中,25℃恒溫培養(yǎng),每天進(jìn)行觀察記錄,保持濕潤。每天觀察時(shí)要開蓋放置20 min左右透氣,對發(fā)霉的且沒有腐爛的種子用蒸餾水沖洗后繼續(xù)進(jìn)行發(fā)芽,統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù),觀察連續(xù)5 d無發(fā)芽種子即發(fā)芽停止。

    發(fā)芽率計(jì)算方法為:發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供勢種子數(shù)×100%。

    1.2.2種子生活力測定

    溴麝香草酚藍(lán)(BTB)法[10]:將完整無損的種子在25℃下浸泡2 h后去皮,煮沸失活種子做對照,適當(dāng)距離放入冷卻好的凝膠培養(yǎng)皿內(nèi),放入25℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,放置pH為5.5~9.0的精密試紙,觀察pH試紙上出現(xiàn)黃色暈圈的為有活力種子,反之為無活力種子,統(tǒng)計(jì)記錄。

    紙上熒光法[11]:將完整無損的種子在25℃下浸泡2 h后去皮,放在濕濾紙上放置2 h風(fēng)干濾紙,于紫外熒光燈下照射種子發(fā)光情況,發(fā)光為無生活力種子,反之為無活力種子,統(tǒng)計(jì)記錄,將發(fā)光與不發(fā)光種子放入25℃溫箱進(jìn)行發(fā)芽驗(yàn)證。

    紅墨水法[11]:將普通紅墨水按1∶9的比例稀釋作為染色劑,將25℃下浸泡2 h后的種子剝皮,加入配好的紅墨水中置于30℃恒溫染色20 min,沖洗觀察,將煮沸失去活力的種子作對照,種胚不著色或是微著色為有活力種子,反之無活力。

    氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11-12]:煮沸失活種子作對照,配置0.5% TTC溶液,將25℃下浸泡2 h后種子去皮,倒入TTC溶液置于30℃的恒溫箱內(nèi)避光放置1 h,統(tǒng)計(jì)種子顏色。種胚被染成鮮紅色或紅色為有活力的種子,反之為無活力種子。計(jì)算方法為:生活力(%)=有活力種子數(shù)/供勢種子數(shù)×100%。

    1.2.3TTC法最適條件參數(shù)確定

    采用5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),將窄葉藍(lán)盆花種子在不同溫度下,用清水浸泡30 min、60 min、90 min,120 min去皮放入提前清洗好的培養(yǎng)皿中,加不同濃度TTC于培養(yǎng)皿內(nèi),浸沒種子,將培養(yǎng)皿置于不同溫度的恒溫箱內(nèi)避光染色,3次重復(fù),染色30 min、60 min、90 min、120 min時(shí),統(tǒng)計(jì)種子顏色。

    表1 正交實(shí)驗(yàn)生活力測定因素水平

    1.2.4數(shù)據(jù)處理

    采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 四種方法測定種子生活力結(jié)果與發(fā)芽率關(guān)系分析

    2.1.1紅墨水法

    采用紅墨水法對3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力進(jìn)行測定,結(jié)果表明種子生活力與發(fā)芽率差異不顯著(表2)。

    2.1.2紙上熒光法

    紙上熒光法測得3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力值為4種方法中最高,種子生活力與發(fā)芽率差異顯著(表2),發(fā)光與不發(fā)光的種子均有部分種子發(fā)芽。

    2.1.3BTB法

    BTB法測得的3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力均與發(fā)芽率無顯著差異(表2),種子周圍出現(xiàn)黃色光圈不易分辨(圖1)。

    表2 不同方法測定種子生活力比較

    2.1.4TTC法

    TTC法測得的3個(gè)地區(qū)窄葉藍(lán)盆花種子生活力與發(fā)芽率無顯著差異,而且種子染色情況易辨別(圖1)。

    IY :A1.紅墨水法有生活力種子;A2.紅墨水法無生活力種子;B.紙上熒光法有生活力活和無生活力種子;C1.TTC法有生活力種子;C2.TTC法無生活力種子;D.BTB有生活力活和無生活力種子。

    2.1.5不同方法生活力比較

    結(jié)果表明4種方法測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力中,紅墨水法與紙上熒光法差異顯著,紅墨水法測得的種子生活力低于發(fā)芽率,紙上熒光法發(fā)光與不發(fā)光種子均有部分種子發(fā)芽,兩種方法都不適合測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力。BTB法與TTC法測得的種子生活力差異不顯著(P<0.05),都略高于發(fā)芽率。

    2.2 TTC法最佳條件篩選分析

    BTB法與TTC法都可用于對窄葉藍(lán)盆花種子生活力進(jìn)行測定,但BTB法相較于TTC法操作繁瑣且黃色光圈不易觀察,因此測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力最適方法為TTC法。

    采用5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)對TTC法進(jìn)行優(yōu)化,得出結(jié)果(表3)。窄葉藍(lán)盆花種子生活力最低組合為組合1在25℃下浸種30 min,用濃度為0.1%的TTC在25℃恒溫箱中染色避光30 min和組合8在40℃下浸種60 min,用濃度為0.5%的TTC在30℃恒溫箱中染色避光30 min的種子不染色或染有少量淺粉色;生活力最高組合為組合11,在35℃下浸種60 min,用濃度為0.1%的TTC在30℃恒溫箱中染色避光120 min,種子染成鮮紅色或紅色。對所得的正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行極差分析,得出表3,根據(jù)所得極差R值得大小,5個(gè)因素對種子生活力的影響大小為:TTC濃度>染色時(shí)間>浸種時(shí)間>浸種溫度>染色溫度,TTC濃度對種子生活力的測定值影響最大,染色時(shí)間與浸種時(shí)間次之,浸種溫度與染色溫度對種子生活力的測定值影響較小。

    表3 TTC法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    通過分析J1、J2、J3、J4總結(jié)各因素對窄葉藍(lán)盆花種子生活力影響規(guī)律,挑選出測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力的最優(yōu)條件。浸種時(shí)間:隨著浸種時(shí)間變長,種子生活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,J3值達(dá)到最大,90 min為最適浸種時(shí)間;浸種溫度:隨著浸種溫度升高,生活力先升高達(dá)到一定值時(shí)趨于穩(wěn)定,J3達(dá)到最大,之后再升高溫度對生活力影響不顯著,35℃為最適浸種溫度;TTC濃度:隨著TTC濃度的增加,生活力逐漸降低,高濃度TTC抑制種子的種子生活力,TTC濃度為0.1%時(shí)生活力最高;染色溫度:染色的溫度相較于其他因素,對種子生活力影響較小,隨溫度的增加,種子生活力呈先增加后平穩(wěn),溫度達(dá)到35℃后,再增大溫度,種子生活力差異不顯著;染色時(shí)間:生活力隨著染色時(shí)間的增長而升高,種子顏色由淺到深90 min后被染色種子數(shù)穩(wěn)定不變,顏色最深。綜合上述所確定的較優(yōu)組合為窄葉藍(lán)盆花種子在35℃下浸種90 min,用濃度為0.1%的TTC在35℃溫箱中避光染色90 min。

    對正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明(表4)對于5個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有顯著影響。

    表4 TTC法正交實(shí)驗(yàn)方差分析

    3 討論與結(jié)論

    3.1 窄葉藍(lán)盆花種子生活力的最佳測定方法

    種子生活力反映了種子發(fā)芽的潛在能力或種胚具有的生命力,是判斷種子質(zhì)量的重要指標(biāo),真實(shí)的發(fā)芽率小于或等于種子的生活力,并且對于種子質(zhì)量分級有重要的作用[4,13-14]。本研究中采用目前最常用的四種生活力測定方法測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力,結(jié)果顯示紅墨水法測定結(jié)果為生活力低于發(fā)芽率,沈宇峰等[13]用紅墨水法測定白術(shù)種子生活力也出現(xiàn)了生活力低于發(fā)芽率的情況,因此,此方法不適合測定窄葉藍(lán)盆花及白術(shù)種子生活力;紙上熒光法只適合測定含有熒光物質(zhì)種子的生活力,已有研究表明此法用來測定十字花科類種子生活力,效果最佳;BTB法測定窄葉藍(lán)盆花種子周圍黃色光圈不明顯,不宜判斷,孫榮進(jìn)等[15]利用BTB法測定蔓荊子種子生活力,雖然黃色暈圈比較明顯,但死種子和活種子間差異不顯著,難判斷;TTC法測定的種子生活力接近發(fā)芽率且容易辨別種子有無生活力,為最適測定藍(lán)盆花種子生活力的方法。

    3.2 TTC法測定窄葉藍(lán)盆花種子生活力的最佳條件

    本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著TTC染色時(shí)間的增加,染色效果先好后差,這與雷慧霞等研究的芍藥種子生活力的研究結(jié)果相似[12]。通過設(shè)置了不同的染色處理,發(fā)現(xiàn)浸種時(shí)間、浸種溫度、染色時(shí)間、染色溫度、染色濃度均對藍(lán)盆花種子生活力有顯著影響,但是TTC濃度影響最大,染色時(shí)間次之,這與芍藥種子和獨(dú)活種子結(jié)果不同,芍藥種子生活力影響最大的因素是浸種時(shí)而獨(dú)活種子生活力影響最大的因素是染色溫度[12,16],而影響白鮮[17]種子生活力最大的因素是浸種溫度,其次是TTC濃度。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明窄葉藍(lán)盆花種子生活力采用TTC法測定的最佳條件為:種子在35℃下浸種30 min,用濃度為0.1%的TTC在35℃溫箱中避光染色90 min。

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