基于PI3K／AKT／mTOR信號通路研究雙氫青蒿素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬的影響*

朱海洋，孫會卿，張淑鳳，吳賀文

1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，發(fā)病人數(shù)逐年增加，具有極高的發(fā)病率及病死率且易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，嚴(yán)重危害人類生命健康［1］。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種分解細(xì)胞質(zhì)等自身構(gòu)成成分的生理現(xiàn)象，當(dāng)自噬激活時，自身受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)被包裹在囊泡中，傳遞至溶酶體進(jìn)行降解。研究表明，自噬與腫瘤、免疫性疾病及神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，在HCC的進(jìn)展過程中也發(fā)揮著重要作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，抑制腫瘤發(fā)展［2-4］。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物，具有水溶性好、吸收迅速、代謝快、不良反應(yīng)小等優(yōu)點，除具有抗瘧作用外，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多方面藥理作用［5-7］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DHA還具有抗腫瘤活性，對肺癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞有顯著抑制作 用［8-9］。DHA具 有 誘 導(dǎo) 肝 癌 細(xì) 胞 凋 亡 的 作用［10］，但其是否通過調(diào)節(jié)自噬抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。因此，本研究基于PI3K／AKT／mTOR信號通路研究DHA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬的作用，以期為臨床治療HCC提供理論參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞系人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號：RKX1036。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入凍存培養(yǎng)基，置于-80℃冰箱，第2天轉(zhuǎn)至液氮中保存。

1.2 藥物與試劑雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA，成都瑞芬思生物科技有限公司，純度＞98%，貨號：S-102）。胎牛血清、青霉素（純度≥97%）、鏈霉素（純度≥98%）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、MTT、二甲基亞砜、戊二醛溶液（美國Sigma-Aldrich公司，貨號：12103C、19532、85886、189490、M2128、D5879、G5882）；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司，貨號：25200072）；乙醇（純度≥99.5%）、丙醇（純度≥99.9%）、檸檬酸鉛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：E111994、P110345、L303843）；細(xì)胞自噬染色試劑盒（MDC法）、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G0170、SW2020）；胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1，美國Biovision公司，貨號：7507-20）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，貨號：R21250-250T）；兔抗人磷脂肌酰醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）單抗、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）多抗、p-AKT多抗、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）單抗、p-mTOR單抗、Beclin1單抗、微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubule-associated protein light chain 3B，LC3B）單抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國Abcam公 司，貨 號：ab278545、ab8805、ab38449、ab134903、ab109268、ab210498、192890、ab150077）。

1.3 儀器MZDH0850型顯微鏡（美國Lignomat公司）；IX53型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Avanti J-E型高速離心機（美國Beckman公司，離心半徑：8 cm）；JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；E-Gel Imager凝膠成像儀（美國Invitrogen公司）；DYY-4C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取常規(guī)凍存的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，復(fù)蘇，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃恒溫培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞抑制率取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，接種于96孔板，每孔100μL，常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度（0μmol·L-1、6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）DHA的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20μL，孵育4 h，棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，充分震蕩后，用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取光密度（optical density，OD）值，計算細(xì)胞抑制率，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，計算半抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50），即抑制50%細(xì)胞生長時的DHA濃度，并將此濃度用于后續(xù)的實驗研究。

細(xì)胞增殖抑制率＝（1-實驗組OD值／對照組OD值）×100%

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，接種于96孔板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入“2.2項”中不同濃度DHA，培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照記錄。

2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，取10 mL細(xì)胞懸液，接種于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，隨機分為對照組、DHA組、抑制劑組和激動劑組，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，DHA組細(xì)胞以IC50劑量的DHA進(jìn)行干預(yù)，抑制劑組加入含有IC50劑量的DHA+5 mmol·L-1的3-MA（PI3K的抑制劑）的培養(yǎng)基，激動劑組加入含有IC50劑量的DHA+100μg·L-1IGF-1（AKT的激動劑）的培養(yǎng)基，對照組采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心10min，棄去培養(yǎng)液，加入2.5%的戊二醛溶液4℃固定72 h，1%四氧化鋨固定30 min，梯度乙醇和丙醇脫水，樹脂包埋，切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛定位染色，置于電鏡下觀察細(xì)胞自噬情況。

2.5 MDC染色觀察細(xì)胞自噬取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，接種于6孔板，每孔2.5 mL，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分為對照組、DHA組、抑制劑組和激動劑組，按“2.4項”下所描述的方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，1×wash buffer洗滌，每孔加入100μL MDC染液，室溫避光染色45 min，離心收集細(xì)胞，1×wash buffer洗滌2次后，每孔滴加50μL抗淬滅封片液封片后4℃避光保存，熒光顯微鏡下（激發(fā)波長355 nm、阻斷波長512 nm）觀察細(xì)胞自噬情況。

2.6 Western Blot檢測細(xì)胞中PI3K／AKT／m TOR信號通路相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶5mL，待細(xì)胞貼壁后，分為DHA組、抑制劑組、對照組和激動劑組，按“2.4項”下所描述方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液，離心取上清，按照BCA蛋白測定試劑盒說明書要求測定蛋白濃度，校正上樣量，加入SDS上樣緩沖液，100℃水浴15 min，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，TBST洗膜3次，每次5 min，5%脫脂奶粉封閉2 h后，TBST洗膜2次，每次5 min，加入PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、Beclin1、βactin一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書滴加發(fā)光液，曝光顯影后采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DHA對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響與0μmol·L-1組比較，不同濃度DHA作用于SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與24 h比較，不同濃度DHA作用于SMMC-7721細(xì)胞48 h、72 h后，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與48 h比較，不同濃度DHA作用于SMMC-7721細(xì)胞72 h后，細(xì)胞增殖抑制率無明顯差異（P＞0.05）。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制曲線，DHA干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞24 h、48 h、72 h時的IC50值分別為（36.26±4.67）μmol·L-1、（49.68±6.01）μmol·L-1、（71.24±7.79）μmol·L-1。其中，50μmol·L-1DHA作用SMMC-7721細(xì)胞48 h時，對細(xì)胞的增殖抑制率接近48 h時的IC50值，因此，后 續(xù) 實 驗 選 取50μmol·L-1DHA干 預(yù)SMMC-7721細(xì)胞48 h進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。見圖1。

圖1 DHA對SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用

3.2 不同濃度DHA對SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響0μmol·L-1組細(xì)胞形態(tài)正常，呈長梭形；其余各濃度DHA作用于細(xì)胞后，細(xì)胞逐漸失去原有形態(tài)，變短變圓，且隨著濃度增加，變形細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞邊緣模糊不清，不貼壁，懸浮于培養(yǎng)液中。見圖

2。

圖2 不同濃度DHA對SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響（×400）

3.3 透射電鏡觀察DHA對SMMC-7721細(xì)胞自噬的影響對照組可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基復(fù)合體等正常細(xì)胞器，未見自噬泡；DHA組和抑制劑組可見圓形、大小不一、包裹細(xì)胞器或胞漿的自噬泡（箭頭標(biāo)注），細(xì)胞發(fā)生明顯自噬；激動劑組細(xì)胞器清晰，可見少量自噬泡，細(xì)胞自噬程度較輕。提示DHA可誘導(dǎo)SMMC-7221細(xì)胞自噬，加入PI3K抑制劑后，不能阻斷DHA誘導(dǎo)的SMMC-7221細(xì)胞自噬，而加入AKT激動劑后，可阻斷DHA誘導(dǎo)的SMMC-7221細(xì)胞自噬。見圖3。

3.4 MDC染色觀察DHA對SMMC-7721細(xì)胞自噬的影響熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，對照組熒光強度較弱；DHA組和抑制劑組出現(xiàn)大量綠色熒光，熒光強度明顯增強，細(xì)胞發(fā)生明顯自噬；激動劑組熒光減弱，細(xì)胞自噬程度減輕。提示，DHA可促進(jìn)SMMC-7221細(xì)胞自噬，加入PI3K抑制劑后，不能阻斷DHA誘導(dǎo)的SMMC-7221細(xì)胞自噬，而加入AKT激動劑后，可阻斷DHA誘導(dǎo)的SMMC-7221細(xì)胞自噬。見圖4。

圖4 MDC染色觀察DHA對SMMC-7721細(xì)胞自噬的影響（×200）

3.5 DHA對SMMC-7721細(xì)胞中PI3K／AKT／m TOR信號通路相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，DHA組、抑制劑組、激動劑組PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I和Beclin1蛋白相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與DHA組、抑制劑組比較，激動劑組PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ／LC3-I和Beclin1蛋白相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。提示，DHA可抑制SMMC-7221細(xì)胞中PI3K／AKT／mTOR信號通路激活，加入PI3K抑制劑后，不能阻斷DHA對PI3K／AKT／mTOR信號通路的激活，而加入AKT激動劑后，可阻斷DHA激活PI3K／AKT／mTOR信號通路。見表1，圖5，圖6。

圖5 SMMC-7721細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR的蛋白表達(dá)比較

表1 SMMC-7721細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平比較 （±s，n＝5）

表1 SMMC-7721細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平比較 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與DHA組比較，b P＜0.05；與抑制劑組比較，c P＜0.05

／LC3-I Beclin1對照組 0.68±0.07 0.86±0.09 0.51±0.07 0.92±0.09 0.5組別 PI3K AKT p-AKT mTOR p-mTOR LC3-Ⅱ9±0.06 0.25±0.05 0.19±0.04 DHA組 0.26+0.05a 0.87±0.08 0.15±0.04a 0.87±0.08 0.23±0.04a 1.23±0.09a 0.58±0.06a抑制劑組 0.21±0.04a 0.85±0.08 0.11±0.04a 0.83±0.08 0.21±0.04a 1.25±0.10a 0.55±0.05a激動劑組 0.55±0.06abc 0.88±0.09 0.38±0.05abc 0.93±0.09 0.46±0.05abc 0.82±0.09abc 0.38±0.04 abc

注：A：對照組；B：DHA組；C：抑制劑組；D：激動劑組

4 討論

HCC是致死率最高的惡性腫瘤之一，目前臨床上主要治療手段為手術(shù)治療及輔助放化療，但是由于HCC復(fù)發(fā)率高、放化療易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致HCC的預(yù)后極差［11-12］。因此，研究HCC的發(fā)病機制，尋找高效、低毒、安全的抗癌成分是臨床工作者亟待解決的問題。

近年來的研究顯示，從傳統(tǒng)中草藥青蒿中提取出的天然抗癌成分，在緩解患者臨床癥狀、延緩病情方面療效顯著［13-14］。DHA是青蒿素的一種衍生物，能參與抑制腫瘤細(xì)胞增殖的多個環(huán)節(jié)，可通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞生長周期阻滯等發(fā)揮抗腫瘤活性［15-16］。同時，DHA的抗腫瘤活性還表現(xiàn)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖等方面［17-18］。本研究采用不同濃度DHA作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨著DHA濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，提示DHA對SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。

自噬是細(xì)胞的一種自我分解代謝過程，是應(yīng)急情況下維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及代謝平衡的重要機制，其功能改變或缺失與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［19］。研究發(fā)現(xiàn)，自噬對HCC的發(fā)生發(fā)展表現(xiàn)出促進(jìn)和抑制的雙重作用，一方面，自噬可在HCC起始階段抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展；另一方面，自噬可在HCC發(fā)展過程中為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖［20-21］。研究表明，DHA在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用，可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞及膽管癌細(xì)胞系發(fā)生自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22-24］。本研究透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DHA組可見較多的自噬泡；同時MDC染色顯示，DHA組熒光強度最強，提示DHA具有誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞自噬的作用。

自噬的發(fā)生由多種基因和蛋白通過多條信號通路共同發(fā)揮調(diào)控作用，其中PI3K／AKT／mTOR信號通路是負(fù)性調(diào)控自噬的經(jīng)典途徑，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。PI3K在自噬早期發(fā)揮重要作用，不同細(xì)胞因子刺激可導(dǎo)致PI3K被激活，進(jìn)一步活化AKT，使AKT發(fā)生磷酸化，之后將信號傳至mTOR，觸發(fā)mTOR磷酸化，從而激活PI3K／AKT／mTOR信號通路，調(diào)控下游相關(guān)因子，對細(xì)胞自噬發(fā)揮抑制作用［25］。LC3是自噬體的標(biāo)記蛋白，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種剪切形式，自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，LC3-Ⅱ是發(fā)生自噬的標(biāo)志性蛋白，二者比值與自噬程度有關(guān)。Beclin1是自噬體形成過程中的必需分子，調(diào)控自噬體的形成與成熟。mTOR通過影響自噬體的形成，對自噬起負(fù)調(diào)控作用，PI3K蛋白可與Beclin-1形成復(fù)合物，參與溶酶體的形成，調(diào)控自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，采用PI3K特異性抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后，與對照組比較，細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著升高，PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)水平顯著下降；采用AKT特異性激動劑IGF-1預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著下降，PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)水平上升，表明PI3K／AKT／mTOR信號通路參與SMMC-7721細(xì)胞自噬。研究表明，miR-27a可通過靶向抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬和凋亡［26］。另外，抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路，可促進(jìn)自噬，減弱卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特性［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA組細(xì)胞LC3-Ⅱ／LC3-I和Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著下降，PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平上升，與抑制劑組效果一致，而與激動劑作用相反，提示，DHA可能是通過抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用。

綜上所述，DHA可誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖，其機制可能與抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路有關(guān)，為臨床治療HCC提供一定理論參考。