組蛋白去乙?；敢种苿?duì)肝癌誘導(dǎo)自噬的作用

莊 薇 鐘 寧

1 江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院(南昌 330052)

2 江西省腫瘤醫(yī)院(南昌 330006)

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病之一，在我國，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率較高，占全球的50%左右[1- 2]，每年我國有逾13萬人死于該疾病[3]。原發(fā)性肝癌在早期不易察覺，隨后的病情進(jìn)展迅速，這導(dǎo)致原發(fā)性肝癌的預(yù)后差，5年生存率只有12%左右[4- 5]，嚴(yán)重?fù)p害了人們的健康與生命。因此，我們的努力方向就是要明確原發(fā)性肝癌的發(fā)生原因和進(jìn)展機(jī)制，為肝癌尋找到新的治療途徑已然成為醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。曲古霉素作為一種新型的抗腫瘤藥物，屬于組蛋白去乙酰化酶抑制劑的一種，其具有抑制多種惡性腫瘤進(jìn)展的作用[6- 7]，但是具體的作用機(jī)制還不是十分明確。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察曲古霉素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡是否有影響，該影響是否與自噬有關(guān)，這個(gè)作用機(jī)制可為臨床上治療肝癌開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞 HepG2(ATCC公司)；曲古霉素(Sigma公司)；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)；MTT試劑(Sigma公司)；Western blot相關(guān)試劑(Sigma公司)；Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博公司)；RT和逆轉(zhuǎn)錄等相關(guān)試劑(Fermentas公司)；β-actin(Abcam 公司)；引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞 HepG2置于含有10%FBS、青霉素與鏈霉素各100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基中，然后置于CO2培養(yǎng)箱中，5%CO2、37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

把處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞鋪滿96孔板孔底，置于CO2培養(yǎng)箱中，5%CO2、37℃進(jìn)行培養(yǎng)，等到細(xì)胞貼壁后依次加入濃度梯度的藥物，即濃度為50、100、200和500 nmol/L的曲古霉素，使用曲古霉素處理 HepG2 細(xì)胞的同時(shí)對(duì)照組加入相同量的培養(yǎng)液，每一組濃度均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。待48 h后每孔均加入 20 μL MTT (5 mg/mL)，維持條件不變繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后終止培養(yǎng)，吸棄其上清后，每孔中加入150 μL的二甲基亞砜，輕微振蕩10 min，運(yùn)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm 波長處各孔的吸光度(optical density, OD)的值，OD值的大小與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用 Annexin V/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒來檢測(cè)細(xì)胞凋亡的總體情況，仍然是使用處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞，將其分別接種于6孔板中，等到細(xì)胞貼壁后依次加入濃度梯度的曲古霉素，48 h 后用離心管收集細(xì)胞離心，條件5 min、1 000 r/min，棄去上清后用200 μL流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，然后再依次加入5 μL的Annexin V-FITC 和5 μL的碘化丙啶(propidium iodide, PI)，輕輕搖晃混勻，注意室溫避光保存，務(wù)必在30 min以內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 Western blot法

此階段處理細(xì)胞的方法同1.4，結(jié)束培養(yǎng)后細(xì)胞中加入RIPA裂解液，充分地震蕩，12 000 r/min，離心10 min后收集上清，隨即進(jìn)行蛋白定量，可置于- 80 ℃冰箱中貯存。進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，待電泳結(jié)束轉(zhuǎn)膜而后室溫下封閉2 h，加入一抗以后4 ℃孵育過夜；孵育一抗的膜使用緩沖液充分沖洗，隨后加入相應(yīng)的二抗孵育2 h，洗膜，加入ECL試劑，用凝膠成像并用圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，截取圖片并記錄相關(guān)條帶灰度值。

1.6 RT-PCR法

處理細(xì)胞的方法同1.4。引物序列從Gene Bank中查閱，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)。β-actin：上游5′-GTGTGATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACT- 3′，下游5′-ATGGCATGAGGGAGCGCGTAACCCTCA-TAG- 3′；Beclin1：上游5′-GACCAGTGGGCATCGCA-TCG- 3′，下游5′-CTGGTTGGCTGATGCTACTG- 3′；Bcl- 2：上游5′-TGCCACCATCACTCAATACC- 3′，下游5′-AAACGCCAATAGCACGGTGA-3′。實(shí)驗(yàn)過程使用Trizol一步法提取細(xì)胞的RNA；具體操作過程參照RT試劑盒程序進(jìn)行RT及PCR反應(yīng)，所得的cDNA可置于- 20 ℃冰箱保存以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用；以cDNA為模板，在聚合酶的催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 2min；95 ℃ 30 s，退火30 s，70 ℃ 1 min，70 ℃，2 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，配制瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用凝膠成像以及圖像分析系統(tǒng)成像并進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各mRNA的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TSA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的曲古霉素分別作用于HepG2肝癌細(xì)胞后，我們可以觀察到HepG2肝癌細(xì)胞的增殖情況，隨著藥物作用時(shí)間的延長以及藥量的增加增殖所受到的抑制越明顯，與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=237.69，P<0.05，表1)。

表1 不同濃度TSA 對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制

2.2 TSA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的 TSA 對(duì) HepG2細(xì)胞凋亡的影響。與對(duì)照組相比較，200 nmol/L TSA 處理細(xì)胞以后，其凋亡百分?jǐn)?shù)增加(F=335.14，P=0.041，圖1)。

圖1 TSA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 TSA對(duì)HepG2細(xì)胞Beclin1和Bcl- 2蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的 TSA(100、200 nmol/L) 在處理HepG2細(xì)胞48 h以后，Beclin1蛋白的表達(dá)逐漸上調(diào)(F=511.93，P=0.029)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Bcl- 2蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)(F=197.24，P=0.032)，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖2、圖3)。

圖2 HepG2細(xì)胞Beclin1和Bcl- 2蛋白的表達(dá)

2.4 TSA對(duì)HepG2細(xì)胞Beclin1和Bcl- 2 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明，不同濃度的TSA(100、200 nmol/L) 處理HepG2細(xì)胞48 h以后，Beclin1mRNA的表達(dá)逐漸上調(diào)(F=258.41，P=0.039)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Bcl- 2 mRNA的表達(dá)在逐漸下調(diào)(F=1 082.62，P=0.04)，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖3)。

圖3 HepG2細(xì)胞Beclin1和Bcl- 2mRNA的表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)過程，是由基因所控制的一種細(xì)胞自主而有序的死亡，其目的是為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，是一個(gè)極其復(fù)雜的過程。迄今為止我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的凋亡可以由現(xiàn)有的大多數(shù)抑制腫瘤的藥物所誘導(dǎo)，這也是這些藥物治療腫瘤的途徑之一。因此，我們?cè)u(píng)價(jià)腫瘤治療是否有效的指標(biāo)之一就是看這個(gè)藥物能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞在缺乏能量或者外界刺激等因素作用下的一種自我消化的過程，通過自噬的作用，生物機(jī)體可以將自身的蛋白、細(xì)胞器以及細(xì)胞質(zhì)包裹、消化和降解，由此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器更新以及自身代謝的目的。自噬很少發(fā)生，可以由某些因素所誘導(dǎo)，細(xì)胞保持一種自噬對(duì)于細(xì)胞本身以及機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有非常重要的生物學(xué)作用[9]。與此同時(shí)自噬不僅僅可以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)它還可以誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡[10]，在腫瘤細(xì)胞中，這種現(xiàn)象尤為明顯，自噬可以緩解腫瘤細(xì)胞增殖帶來的壓力，但是同時(shí)自噬又會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡，而這種死亡與細(xì)胞凋亡以及一般的細(xì)胞程序性死亡不同，它是一種新的程序性細(xì)胞死亡，人們稱其為細(xì)胞自噬性死亡[11- 12]。

研究顯示，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，表觀遺傳調(diào)控起著非常重要的作用，這是一種不改變DNA序列，但是卻可以影響基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控方式，表觀遺傳調(diào)控的現(xiàn)象有很多，組蛋白乙酰化(和)或去乙?；揎椌褪瞧渲幸环N，組蛋白及非組蛋白乙?；瘯?huì)保持一種平衡，這種平衡的打破與腫瘤的發(fā)生以及惡性進(jìn)展有著密切關(guān)聯(lián)，目前該靶點(diǎn)有望成為治療腫瘤的新途徑，已然成為目前抗癌治療和腫瘤靶向治療聯(lián)合用藥領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。組蛋白去乙酰化酶抑制劑是通過提高細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭?，誘發(fā)DNA損傷、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和(或)凋亡，從而最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。有研究顯示，組蛋白去乙?；敢种苿?duì)腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡和細(xì)胞程序性死亡這三種途徑均有顯著影響，其誘導(dǎo)的自噬可以發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞的死亡，與自噬抑制劑聯(lián)用或敲除自噬調(diào)控的關(guān)鍵基因Atg5基因均會(huì)減弱組蛋白去乙?；敢种苿┑募?xì)胞毒性作用[13- 14]。曲古霉素就是一種組蛋白去乙?；敢种苿钪饕淖饔镁褪强拐婢?，此外對(duì)陰道滴蟲、梅毒螺旋體以及阿米巴原蟲也有一定的作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)乳腺癌等多種腫瘤亦具有抑制作用[15]。曲古霉素可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，但是其誘導(dǎo)的自噬與細(xì)胞死亡之間的聯(lián)系，在不同的用藥以及不同性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞中均存在著一定差異，這個(gè)環(huán)節(jié)還需要我們進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

目前的研究表明，存在著某些自噬基因在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá),許多抗腫瘤藥物治療途徑都是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡而實(shí)現(xiàn)的[16- 17]。Beclin1作為一種自噬基因，是候選的腫瘤抑制基因，也是目前所發(fā)現(xiàn)的參與自噬調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，其在多種腫瘤細(xì)胞中均有所表達(dá)[18]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌、乳腺癌以及前列腺癌中均存在Beclin1基因的缺失性突變，Ding等[19]研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中Beclin1的表達(dá)會(huì)明顯低于其周邊正常組織，而且肝癌的惡性程度與Beclin1表達(dá)的水平有相關(guān)性，在同步進(jìn)行的細(xì)胞試驗(yàn)中還證實(shí)了Beclin1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。任寧等[20]研究同樣證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)，他們通過體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)自噬可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖。Beclin1還能夠與凋亡相關(guān)蛋白Bcl- 2結(jié)合形成 Beclin1/Bcl- 2 復(fù)合體，參與調(diào)控細(xì)胞的自噬和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

通過本實(shí)驗(yàn)我們可以看到曲古霉素能明顯抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增長，且這種抑制作用會(huì)隨著曲古霉素作用時(shí)間的延長、藥量的增加而逐漸增強(qiáng)，這就告訴我們曲古霉素是可以抑制HepG2肝癌細(xì)胞繁殖的。在使用了200 nmol/L的曲古霉素處理HepG2細(xì)胞48 h以后，RT-PCR與WB法檢測(cè)結(jié)果均顯示自噬基因Beclin1 mRNA及蛋白的表達(dá)均上調(diào)，而抑凋亡蛋白Bcl- 2 mRNA及蛋白的表達(dá)均下調(diào)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明在TSA作用于HepG2細(xì)胞的過程中，凋亡與自噬兩種方式同時(shí)存在，且兩種方式會(huì)相互影響，可能是TSA通過干擾Bcl- 2/Beclin1復(fù)合體的結(jié)合，誘導(dǎo)自噬的同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。