廣西玉林火龍果炭疽病病原菌的分離與鑒定

馬文娟，劉月廉，梁拾睿

（1.廣西壯族自治區(qū)興業(yè)縣土壤肥料工作站 興業(yè)縣 537800；2.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院 湛江市 524088；3.興業(yè)縣大平山鎮(zhèn)人民政府 興業(yè)縣 537800；）

火龍果（Hylocereus undulatusBritt）是深受人們喜愛的熱帶水果之一。20 世紀(jì)90 年代初開始引進(jìn)臺(tái)灣試種, 并馴化改良, 在廣東、海南、福建、廣西等省區(qū)陸續(xù)引種栽培。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，火龍果已被廣西列入“十三五”重點(diǎn)發(fā)展水果品種之一，到2020 年，廣西計(jì)劃種植火龍果面積達(dá)到13 300 ha，產(chǎn)量突破500 000 t[1]?；瘕埞N植在玉林市也在興起，到2020年底，全市發(fā)展火龍果面積近1 333.33 ha，其中興業(yè)縣155.33 ha（興業(yè)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提供數(shù)據(jù)）。隨著種植面積不斷擴(kuò)大，病害問題日益突出，嚴(yán)重影響了火龍果的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的火龍果病害主要有潰瘍?。∟eoscytalidium dimidiatum）、炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides，C.truncatum和Gloeosporiumsp.）、果 腐 ?。˙ipolarisca ctivora）、枯萎 ?。‵usarium oxysporum）、黑斑病（Alternariasp.）和枯斑?。∟ectriellasp.）等[2-3]，已有研究表明，引起貴州和海南火龍果炭疽病的病原為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和平頭炭疽菌（C.truncatum）[2,4]。而引起廣西欽州火龍果炭疽病的病原為盤圓孢屬（Gloeosporiumsp.）[5]。當(dāng)前國(guó)外報(bào)道引起火龍果炭疽病的病原主要為C.siamense（印度）、C.fructicola（菲律賓）、C.aenigma和C.siamense（泰國(guó)）、C.karstii（巴西）、C.gloeosporioides（美國(guó)和日本）[6-11]。

2020 年5 月，在廣西玉林興業(yè)縣太平鎮(zhèn)火龍果種植區(qū)發(fā)生了嚴(yán)重的炭疽病，發(fā)病率約為25%，通過初步采樣研究，發(fā)現(xiàn)與國(guó)內(nèi)報(bào)道的病原不同，為了明確該病原種類，本研究開展了該病害的病原鑒定，旨在為該病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及樣本采集

2020年4 月，在廣西玉林興業(yè)縣太平鎮(zhèn)火龍果種植區(qū)（22°94′97′N,109°91′79′E）針對(duì)火龍果枝條（莖）炭疽病進(jìn)行病情調(diào)查及采樣，同時(shí)采集健康無病枝條（莖），分別置于PE無菌采樣袋，帶回廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院植保實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。

1.2 菌株的分離與純化

選取感病的火龍果枝條（莖），病健交界處剪取2 mm×2 mm 的小塊，70%乙醇消毒30 s，然后將其轉(zhuǎn)入0.1%升汞消毒1 min，用無菌水清洗3遍后，用滅菌濾紙吸干, 置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)。3~5 d后，待分離物上長(zhǎng)出菌絲，挑取菌落邊緣接種在新的PDA 平板純化培養(yǎng)，然后將純化菌株進(jìn)行稀釋平板涂布，獲得單菌落，并接入斜面試管中在25 ℃培養(yǎng)3~5 d，然后置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株的致病性測(cè)定

將PDA 上培養(yǎng)7d的分離菌株，用直徑5 mm的打孔器制取菌餅，然后把菌餅接種于有傷口的離體火龍果枝條（莖）上，以無菌PDA 培養(yǎng)基無菌餅作為對(duì)照，置于用無菌濾紙保濕的塑料盒中，保濕7~10 d。癥狀表現(xiàn)后，從接種發(fā)病的病斑上再次分離病原菌并進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.4 致病菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)特征

將致病菌株接種至PDA平板培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)，定期觀察致病菌株的菌落生長(zhǎng)，記錄菌落的顏色、形態(tài)及生長(zhǎng)情況，在光學(xué)顯微鏡下拍照記錄致病菌株的分顯微形態(tài)。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

致病菌株基因組DNA 提取參考Lu 等的方法提取病原菌的DNA[12]。對(duì)病原真菌的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）、肌動(dòng)蛋白基因（actin gene,ACT）、幾丁質(zhì)合成酶A 基因（chitin synthase A gene,CHS-1）和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene,GAPDH）[13]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后，送到廣州華大測(cè)序中心進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列向GenBank 數(shù)據(jù)庫提交，并獲得登錄號(hào)。同時(shí)將序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對(duì)，并選取同源性較高和模式菌株序列按ITS、ACT、CHS-1和GAPDH順序進(jìn)行連接，用MEGA7.0 中的最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)[14]，確定病原菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果炭疽病病情調(diào)查及發(fā)病癥狀

通過對(duì)約0.667 ha火龍果園的田間調(diào)查，火龍果炭疽病的發(fā)病率約為25%。該病田間主要為害枝條（莖），初期為淡黃色近圓形點(diǎn)狀病斑，后期為黃褐色至黑褐色近圓形斑，病斑中央凹陷，邊緣呈輪紋狀，且表面著生褐色小點(diǎn)，呈典型炭疽病癥狀，如圖1所示。病斑不限于枝條（莖）的尖部或邊緣（圖1-a）。

圖1 火龍果炭疽病

2.2 分離的菌株

通過病樣的分離，純化，單孢分離，獲得單孢菌株3 個(gè)，分別編號(hào)為HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3。分別對(duì)3個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.3 菌株的致病性

菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3 分別接種于健康枝條（莖），5 d 后開始發(fā)病，所有接種部位均變黑腐爛并凹陷（圖1-b），其發(fā)病癥狀與田間采集樣品癥狀相似，而對(duì)照未發(fā)?。▓D1-c）。對(duì)接種后發(fā)病組織進(jìn)行再次分離純化，獲得的菌株與接種菌株形態(tài)特征一致。說明所分離的菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3均為致病菌。

2.4 病原菌形態(tài)特征

在28 ℃條件下，菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3在PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色至灰色，分生孢子為單細(xì)胞，透明、柱狀、兩端鈍化，大小為（13.8~16.5） μm×（4.0~5.5） μm（n=50）。附著胞呈橢圓形至不規(guī)則形，呈暗褐色，大小在（5.6~8.5） μm×（4.5~6.5） μm 之間（n=20）（圖1-d 和e）。菌株形態(tài)特征與已報(bào)道文獻(xiàn)中暹羅刺盤孢菌（Colletotrichum siamense）的描述一致[15]。

2.5 致病菌株的分子生物學(xué)特性

菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3 經(jīng)過PCR擴(kuò)增、測(cè)序以及向GenBank 數(shù)據(jù)庫提交序列，獲得登錄號(hào)，按順序分別是MZ723903、MZ723904和MZ723905 （ITS）；MZ736568、MZ736569 和MZ736570 （ACT）； MZ736571、 MZ736572 和MZ736573 （CHS-I）；MZ736574、MZ736574 和MZ736574（GAPDH）。

將所得序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示，致病菌株的ITS、ACT、CHS-I和GAPDH序列與C.siamense的 模 式 菌 株ICMP 18578 （JX010171，F(xiàn)J907423、JX009865 和JX009924）和其他多個(gè)菌株同源性達(dá)到99%~100%?；贗TS、ACT、CHSI和GAPDH基因，從GenBank中選取的序列，采用最大似然法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3 與 模式菌株ICMP 18578聚在同一分支，而與其他種有較大的遺傳距離（圖2）。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合分離菌株的形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定和多基因序列分析，確定引起廣西玉林興業(yè)縣太平鎮(zhèn)火龍果種植區(qū)的炭疽病為暹羅刺盤孢菌（C.siamense）。

3 討論與結(jié)論

炭疽病是植物最常見病害之一，但其病原種類復(fù)雜，多樣性高，僅用形態(tài)學(xué)或單基因分析難以明確其分類地位[12]。因此，采用ITS、ACT、CHS-I和GAPDH的多基因序列分析能更科學(xué)地明確病原菌的分類地位，這將有助于在生產(chǎn)上對(duì)該病害的有效管理。本研究綜合分離菌株的形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定和多基因序列分析，確定引起廣西玉林興業(yè)縣太平鎮(zhèn)火龍果種植區(qū)的炭疽病為暹羅刺盤孢菌（C.siamense），是國(guó)內(nèi)的首次報(bào)道。