GC法測定潛在基因毒性雜質(zhì)1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯

閔婕，王恩，林萍，蘭公劍

GC法測定潛在基因毒性雜質(zhì)1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯

閔婕，王恩，林萍，蘭公劍*

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

建立了潛在基因毒性雜質(zhì)1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯的GC-FID檢測方法。采用DB-624 （30 m×0.32 mm，1.8 μm）毛細(xì)管色譜柱，柱溫為程序升溫，載氣流速為2.0 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度為280 ℃，檢測器溫度為280 ℃，進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比為10∶1。結(jié)果表明：1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯在0.92～13.82 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（=0.999 8），檢測限為0.46 μg·mL-1，定量限為 0.92 μg·mL-1，加標(biāo)回收率平均值為115.7%（=1.5%，=9）。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確簡便，適用于潛在基因毒性雜質(zhì)1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯的測定。

1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯；潛在基因毒性雜質(zhì)；氣相色譜法

基因毒性雜質(zhì)或者潛在基因毒性雜質(zhì)存在于藥物生產(chǎn)的各個階段，起始物料、中間體、副產(chǎn)物、催化劑、殘留溶劑、原料藥儲存不當(dāng)?shù)染赡芤牖虍a(chǎn)生基因毒性雜質(zhì)[1-2]。目前對磺酸酯類[3]、亞硝胺類[4]、鹵代烷烴[5-7]等基因毒性雜質(zhì)的研究在不斷深入，可采用多種方法進(jìn)行評估和分析，并量化控制基因毒性雜質(zhì)，以保障用藥安全。

1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯（雜質(zhì)A）是醫(yī)藥化工產(chǎn)品4-[1-(2,3-二甲基苯基)乙基]-1H-咪唑的合成起始物料，其結(jié)構(gòu)中含鹵代烷烴的基因毒性雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)，為潛在基因毒性雜質(zhì)，目前尚未有文獻(xiàn)報導(dǎo)雜質(zhì)A的檢測方法。雜質(zhì)A在水相體系中不穩(wěn)定，易水解生成1-(2,3-二甲基苯基)乙醇（雜質(zhì)B），反應(yīng)過程見圖1。因此，本文開發(fā)了氣相色譜分析方法，可良好分離雜質(zhì)A和雜質(zhì)B，該方法靈敏度 高[11]，適用于潛在基因毒性雜質(zhì)A的檢測。

圖1 雜質(zhì)A的水解反應(yīng)路線圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7697A-7890B氣相色譜儀，美國Agilent公司；XSE205DU型電子天平，美國梅特勒-托利多公司。

1.2 試藥

中間體4-[1-(2,3-二甲基苯基)乙基]-1H-咪唑，99%，批號01、02、03，南京正大天晴制藥有限公司；雜質(zhì)A對照品，91%，濟(jì)南誠匯雙達(dá)化工有限公司；雜質(zhì)B，99%，上海升華醫(yī)藥科技有限公司；乙腈，色譜純，天地試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

溶劑：乙腈。

對照品貯備液：取雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對照品各約15 mg，精密稱定，置200 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋定容，制成每1 mL中約含75 μg的溶液。

對照品溶液：精密量取雜質(zhì)A對照品貯備液 2 mL，置20 mL量瓶中，用溶劑稀釋定容，制成每1 mL中約含7.5 μg的溶液。

供試品溶液：取樣品約0.2 g，精密稱定，置 20 mL量瓶中，加溶劑超聲溶解，并稀釋定容，制成每1mL中約含10 mg的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取樣品約0.2 g，精密稱定，置20 mL量瓶中，加入雜質(zhì)A、雜質(zhì)B對照品貯備液各2 mL，加溶劑超聲溶解并稀釋定容，制成每 1 mL中約含樣品10 mg、雜質(zhì)A和雜質(zhì)B各7.5 μg的溶液。

2.2 色譜參數(shù)

色譜柱：DB-624（30m×0.32mm，1.8 μm）；柱溫：起始溫度60 ℃，維持2 min，以20 ℃·min-1的速率升溫至160 ℃，維持10 min，再以20 ℃·min-1的速率升溫至240 ℃，維持15 min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；檢測器（FID）溫度為280 ℃；載氣為氮氣，流速為2.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比為10∶1。

2.3 專屬性

精密量取空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液各1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，如圖2所示。由圖2可知，空白溶劑對雜質(zhì)A出峰無干擾，系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)A與雜質(zhì)B之間的分離度為2.0，供試品溶液中無其他雜質(zhì)峰干擾雜質(zhì)A，結(jié)果表明，該方法專屬性良好。

a—空白溶劑；b—對照品溶液；c—供試品溶液；d—系統(tǒng)適用性溶液

2.4 線性與范圍

分別精密量取雜質(zhì)A對照品貯備液0.2、0.4、1.0、1.6、2.0、3.0 mL，置20 mL量瓶中，加溶劑稀釋定容，作為10%、20%、50%、80%、100%和150%系列的線性溶液。取上述系列線性溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（）與相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸分析，計算回歸方程：=1.232 6+0.122 0。結(jié)果表明，雜質(zhì)A在質(zhì)量濃度0.92～13.82 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，響應(yīng)因子為7.8%。

2.5 定量限、檢測限

取雜質(zhì)A對照品溶液，逐級稀釋，按信噪比 ≥10∶1配制成定量限溶液；按信噪比約為≥3∶1配制成檢測限溶液。精密量取各溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。定量限結(jié)果為 0.92 μg·mL-1，平行配制6份，峰面積為3.6%；檢測限結(jié)果為0.46 μg·mL-1。

2.6 準(zhǔn)確度

回收率溶液：取樣品約0.2 g，精密稱定，置 20 mL量瓶中，精密加入雜質(zhì)A對照品貯備液1.0、2.0、3.0 mL，加溶劑超聲溶解并稀釋定容，作為50%、100%、150%回收率溶液，精密量取各溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。雜質(zhì)A的平均回收率為115.7%，為1.5%（=9），方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 精密度

2.7.1 進(jìn)樣精密度

取“2.1”項下對照品溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6針，考察儀器的進(jìn)樣精密度。連續(xù)進(jìn)樣6次，雜質(zhì)A保留時間為0.1%，峰面積為2.2%，進(jìn)樣精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性

照“2.6”項下100%回收率溶液，平行配制 6份，取“2.1”項下對照品溶液、重復(fù)性溶液 1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。6份重復(fù)性溶液中雜質(zhì)A的檢出量平均值為0.11%，為1.4%（=6），方法的重復(fù)性良好。

2.7.3 中間精密度

為考察隨機(jī)變動因素對精密度的影響，由另一名分析員獨立建立系統(tǒng)，重新配制6份重復(fù)性溶液，在不同的日期采用不同儀器進(jìn)行檢測。12份溶液中雜質(zhì)A的檢出量平均值為0.10%，為3.8%（=12），方法的中間精密度良好。

2.8 耐用性

2.8.1 溶液穩(wěn)定性

取“2.1”項下對照品溶液和供試品溶液，室溫條件下，分別在0、5、12、24、42 h測定。結(jié)果表明，不同時間點對照品溶液中雜質(zhì)A峰面積與0 h峰面積的比值在88.3%～101.4%之間，對照品溶液在室溫條件下42 h內(nèi)穩(wěn)定；供試品溶液在室溫放置 42 h內(nèi)，不同時間點均未檢出雜質(zhì)A，供試品溶液在室溫條件下42 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.2 耐用性

調(diào)整色譜條件參數(shù)（流速2.0±0.2 mL·min-1、柱初溫60±5 ℃、進(jìn)樣口溫度280±5 ℃），取“2.1”項下系統(tǒng)適用性溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。不同色譜條件下雜質(zhì)A的理論板數(shù)均大于20 000，拖尾因子均為1.0，與雜質(zhì)B的分離度均大于2.0，檢出量的極差為0.01%，方法的耐用性良好。

2.9 樣品測定

照氣相色譜法（中國藥典2020年版四部通則0521）試驗，取3批中間體，按“2.2”項下方法測定雜質(zhì)A的質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，3批中間體中雜質(zhì)A均未檢出。

3 結(jié)果與討論

3.1 雜質(zhì)A限度計算

按治療時長超過10年，根據(jù)TTC法[9]（毒理學(xué)關(guān)注閾值），長期用藥品種的基因毒雜質(zhì)每日允許最大攝入量為1.5 μg[10]。原料藥每日最大劑量為2 mg，則規(guī)定中間體4-[1-(2,3-二甲基苯基)乙基]-1H-咪唑中雜質(zhì)A的控制限度為0.075%（1.5 μg·d-1/2 mg·d-1）。

3.2 色譜柱的選擇

根據(jù)雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的極性，選擇中等極性色譜柱DB-624（30m×0.32mm，1.8 μm），采用程序升溫，分離雜質(zhì)A和雜質(zhì)B。結(jié)果顯示，該色譜柱的色譜峰峰型良好。

3.3 升溫程序的選擇

為使雜質(zhì)A和雜質(zhì)B能夠完全分離，且不受其他物質(zhì)的干擾，對升溫程序進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，升溫至160 ℃，維持10 min，雜質(zhì)A可與雜質(zhì)B完全分離，空白溶劑無干擾。

4 結(jié) 論

本文建立氣相色譜法測定潛在基因毒性雜質(zhì)1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確方便，適用于檢測醫(yī)藥化工產(chǎn)品4-[1-(2, 3-二甲基苯基)乙基]-1H-咪唑。本文為潛在基因毒性雜質(zhì)1-(1-氯乙基)-2,3-二甲基苯的測定提供了新的分析方法。

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Determination of Potential Genotoxic Impurity 1- (1-Chloroethyl)-2,3-Dimethylbenzene by GC

（Nanjing Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing Jiangsu 210046, China）

A method for the determination of the potentially genotoxic impurity 1 - (1-chloroethyl) - 2,3-dimethylbenzene by GC-FID was established. A DB-624 was used as capillary column (30m×0.32mm, 1.8μm) (temperature programming), carrier gas flow rate was 2.0 mL·min-1, injection temperature and FID temperature both were 280 ℃. Injection volume was 1.0 μL and the split ratio was 10∶1. The calibration curve was well linear for 1-(1-chloroethyl)-2,3-dimethylbenzene in the range of 0.92～13.82μg·mL-1(= 0.9998). The LOD and LOQ were 0.46 μg·mL-1and 0.92 μg·mL-1, respectively．The average recovery was 115.7%, withof 1.5% (=9). The method is sensitive, accurate and convenient. It is suitable for the determination of the potential genotoxic impurity 1- (1-chloroethyl)-2,3-dimethylbenzene.

1-(1-Chloroethyl)-2,3-dimethylbenzene; Potentially genotoxic impurity; GC

2021-08-20

閔婕（1990-），女，江蘇省南京市人，工程師，碩士， 2015畢業(yè)于沈陽化工大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)專業(yè)，研究方向：藥物分析。

蘭公劍（1981-），男，高級工程師，研究方向：藥物分析、藥品質(zhì)量研究與管理。

O657.7

A

1004-0935（2022）03-0442-03