基于免疫組化的膀胱浸潤性尿路上皮癌的分子分型

祝 穎，蔣智銘，周 雋，徐耀庭，鄒 強(qiáng)，王 洋，陳春燕，茅培青，陳藝琳

膀胱浸潤性尿路上皮癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤，其分子和免疫表型、組織學(xué)形態(tài)、臨床預(yù)后以及對(duì)治療的反應(yīng)均存在顯著個(gè)體差異，目前缺乏可用于精準(zhǔn)化治療的靶向藥物。膀胱浸潤性尿路上皮癌的分子分型目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)膀胱浸潤性尿路上皮癌具有類似乳腺癌的分子亞型特征，包括2種亞型：腔面型和基底樣型，有學(xué)者認(rèn)為可用免疫組化法進(jìn)行初步分型[3-5]，但目前尚無可參考的診斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，膀胱浸潤性尿路上皮癌各組織學(xué)變異和浸潤性尿路上皮癌的分子分型之間存在一定的相關(guān)性[6-7]。本文通過對(duì)197例膀胱浸潤性尿路上皮癌的9種常用免疫組化標(biāo)記進(jìn)行分析，探討通過免疫組化法對(duì)膀胱浸潤性尿路上皮癌進(jìn)行分子分型的可操作性診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2010年6月～2020年6月上海第六人民醫(yī)院病理科及上海市第四人民醫(yī)院病理科存檔的膀胱浸潤性尿路上皮癌197例。所有病例均有完整的臨床病理資料，其中男性167例，女性30例，年齡45～90歲，中位年齡74歲。其中139例(70.6%)為膀胱腫瘤電切標(biāo)本，58例(29.4%)為膀胱癌根治性標(biāo)本。由于膀胱淺表性尿路上皮癌與肌層浸潤性尿路上皮癌屬于兩條不同的癌變通路[8]，二者的免疫表型存在差異，本實(shí)驗(yàn)入組病例包括了兩種標(biāo)本：(1)有明確肌層浸潤的尿路上皮癌173例；(2)有黏膜下廣泛浸潤，因沒有切到肌層而難以判斷是否有肌層浸潤的尿路上皮癌24例。本實(shí)驗(yàn)明確排除了以外生性乳頭狀尿路上皮癌成分為主伴局部黏膜下浸潤的癌，以及以推進(jìn)式生長為主的內(nèi)翻性尿路上皮癌。所有病例切片均經(jīng)兩名副高級(jí)以上職稱病理醫(yī)師重新閱片確診。

除普通型癌外，膀胱浸潤性尿路上皮癌的組織學(xué)變異按WHO和相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[9-10]分為：腺樣變異、鱗樣變異、微乳頭變異、漿細(xì)胞樣變異(包括印戒細(xì)胞樣變異和彌漫型變異)、巢狀變異、肉瘤樣變異。浸潤性尿路上皮癌的各種形態(tài)學(xué)變異常和普通型癌合并存在，本實(shí)驗(yàn)入組的變異型癌腫瘤量至少大于腫瘤總量的20%，并單獨(dú)統(tǒng)計(jì)其免疫表型。

1.2 主要試劑及方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定后脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察。每個(gè)病例選1～2個(gè)浸潤性癌組織塊行CK7、GATA3、FOXA1、CK20、CK14、CD44、CK5/6、p53、Ki-67等9種尿路上皮癌常用免疫組化標(biāo)記。免疫組化采用EnVision兩步法，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽性和陰性質(zhì)控。所有一抗、二抗均購自福州邁新公司，采用Leica自動(dòng)免疫組化機(jī)檢測(cè)，少數(shù)病例加做vimentin、CK(AE1/AE3)、HCK、uroplakinII等其它標(biāo)記。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷免疫組化結(jié)果判讀：≥60%浸潤性癌細(xì)胞陽性定為()；10%～59%的浸潤性癌細(xì)胞陽性定為(+)；<10%的浸潤性癌細(xì)胞陽性定為(-)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]制定的膀胱浸潤性尿路上皮癌基于免疫組化的分子分型標(biāo)準(zhǔn)：(1)純腔面型癌，F(xiàn)OXA1、CK20至少一項(xiàng)為陽性(+/)，CK14、CD44、CK5/6均(-)；(2)腔面為主型癌，F(xiàn)OXA1、CK20至少一項(xiàng)為()，CK14、CD44、CK5/6不超過一項(xiàng)陽性，且陽性細(xì)胞數(shù)不超過(+)；(3)純基底樣癌，CK14、CD44、CK5/6至少一項(xiàng)為陽性(+/)，F(xiàn)OXA1和CK20均(-)；(4)基底為主型癌，CK14、CD44、CK5/6至少一項(xiàng)為()，F(xiàn)OXA1、CK20不超過一項(xiàng)陽性，且陽性細(xì)胞數(shù)不超過(+)；(5)難以分型癌，指腔面型和基底型標(biāo)記超過上述程度的陽性重疊，或全部陰性的浸潤性尿路上皮癌。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 浸潤性尿路上皮癌的免疫表型197例膀胱浸潤性尿路上皮癌中GATA3、CK7、p63、p40陽性例數(shù)分別為171(86.8%)、168(85.3%)、171(86.8%)、148(75.1%)，陽性率均大于75%，其表達(dá)均與腫瘤的分子分型無關(guān)。

根據(jù)本組摸索的分子分型免疫組化分型標(biāo)準(zhǔn)，197例膀胱浸潤性尿路上皮癌中，純腔面型73例，腔面為主型32例，共105例，占53.3%；純基底樣型56例，基底為主型14例，共70例，占35.5%；難以分型22例，占11.2%。FOXA1和CK20的陽性率分別為53.5%(105/197)、57.9%(114/197)，在腔面型癌中的陽性率分別為75.9%(82/105)、86.7%(91/105)，腔面型癌的2種免疫標(biāo)記FOXA1和CK20表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.001)。CK14、CD44、CK5/6的陽性率分別為30.5%(60/197)、51.8%(102/197)、39.6%(78/197)，在基底樣型癌中的陽性率分別為67.1%(47/70)、91.4%(64/70)、77.1%(54/70)，基底樣型癌的3種免疫標(biāo)記CK14、CD44和CK5/6表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.001)。基底樣型癌和腔面型癌的免疫標(biāo)記表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)。相關(guān)蛋白表達(dá)與分子分型有較好的一致性(P<0.001，表1)。

表1 5種免疫標(biāo)記與浸潤性尿路上皮癌分子分型的相關(guān)性

2.2 各種組織學(xué)變異膀胱浸潤性尿路上皮癌的分子分型197例膀胱浸潤性尿路上皮癌中，普通型癌112例(56.9%)，腺樣變異28例(14.2%)，鱗樣變異20例(10.2%)，微乳頭變異11例(5.6%)，漿細(xì)胞樣變異12例(6.1%)，巢狀變異5例(2.5%)，肉瘤樣變異9例(4.6%)。85例有組織學(xué)變異癌中，53例(62.4%)伴有數(shù)量不等的普通型癌。112例普通型癌中，腔面型61例(61/112，54.5%)，基底樣型34例(34/112，30.4%)，難以分型17例(17/112，15.2%)，無明顯相關(guān)性。在85例有組織學(xué)變異癌中，腺樣、微乳頭、漿細(xì)胞樣和巢狀變異的癌明顯多為腔面型癌(圖1、2)，約占76.8%(43/56)，其比例分別為78.6%(22/28)、90.9%(10/11)、66.7%(8/12)、60.0%(3/5)；鱗樣和肉瘤樣變異的癌明顯多為基底樣型癌(圖3)，約占93.1%(27/29)，其比例分別為95.0%(19/20)、88.9%(8/9)，尿路上皮癌的組織學(xué)變異與分子分型存在顯著相關(guān)性(P<0.001，表2)。組織學(xué)變異癌中難以分型的5例均為不同的組織學(xué)變異，無明顯相關(guān)性。

圖1 膀胱浸潤性尿路上皮癌，腺樣變異，腔面型癌：A.HE染色；B.CK14陰性，EnVision法；C.FOXA1陽性(2+)，EnVision兩步法 圖2 膀胱浸潤性尿路上皮癌，巢狀變異，腔面型癌：CK20陽性(2+)，EnVision兩步法 圖3 膀胱浸潤性尿路上皮癌，鱗樣變異，基底樣型癌：A.HE染色；B.CD44陽性(2+)，EnVision兩步法

表2 膀胱浸潤性尿路上皮癌分子分型與組織學(xué)變異的相關(guān)性

2.3 預(yù)后本組有隨訪資料的共116例，81例失訪，隨訪時(shí)間13～65個(gè)月。其中死亡15例，復(fù)發(fā)32例，無復(fù)發(fā)者69例。死亡病例中腔面型癌8例(8/64)，基底樣型癌6例(6/38)，難以分型1例(1/14)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)發(fā)病例中，腔面型癌14例(14/64)，基底樣型癌14例(14/38)，難以分型癌4例(4/14)，基底樣型癌的復(fù)發(fā)率略高，侵襲性略強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

肌層浸潤性尿路上皮癌的總體預(yù)后差，并缺乏個(gè)體化治療的病理參數(shù)，因此目前對(duì)膀胱浸潤性尿路上皮癌分子分型的研究主要集中在肌層浸潤性癌方面，但尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。其中比較有代表性的有兩種：(1)Lund大學(xué)的分子分型[11]依據(jù)不同的基因表達(dá)譜，提出5種不同的分子亞型(分別是Urobasal A型、Urobasal B型、遺傳學(xué)不穩(wěn)定型、鱗狀細(xì)胞癌樣型和異質(zhì)性浸潤型)；(2)TCGA(The Cancer Genome Atlas)分型[12]：依據(jù)對(duì)肌層浸潤癌的基因突變、易位融合和RNA測(cè)序分為5種亞型(分別是腔面-乳頭型、腔面-浸潤型、腔面型、基底-鱗狀型和神經(jīng)型)。此外，還有多名學(xué)者提出許多不同的分型[13-14]。

在對(duì)膀胱浸潤性尿路上皮癌分子分型的研究發(fā)現(xiàn)，這類高度惡性又高度異質(zhì)性的腫瘤有類似浸潤性乳腺癌的特征，可用免疫組化法大致分為腔面型癌和基底樣型癌兩大基本類型。在良性尿路上皮和淺表性尿路上皮癌中，靠近腔面的尿路上皮細(xì)胞CK20、FOXA1表達(dá)強(qiáng)度較高，屬于腔面型標(biāo)記；而靠近基底層的細(xì)胞CK14、CK5/6、CD44表達(dá)強(qiáng)度較高，屬于基底型標(biāo)記。膀胱浸潤性尿路上皮癌由于基因改變類型不同，腫瘤的免疫表型會(huì)出現(xiàn)明顯差異，有的浸潤癌基底型標(biāo)記大量丟失，而腔面型標(biāo)記得以保留；有的則相反，腔面型標(biāo)記大量丟失，而基底型標(biāo)記得以保留。

在本組膀胱浸潤性尿路上皮癌中，雖然CK7、GATA3、p63、p40表達(dá)有時(shí)也會(huì)丟失，但總的陽性率都達(dá)75%～86%，因此這4項(xiàng)標(biāo)記并不適合用于分子分型。根據(jù)文獻(xiàn)[3-6]選擇相關(guān)性較好的FOXA1和CK20作為腔面型癌標(biāo)記，CK14、CK5/6和CD44作為基底樣型癌標(biāo)記。即使這樣仍有一部分癌兩類標(biāo)記會(huì)有輕度重疊，為此我們將腔面型癌分為兩組，一組是純腔面型癌(Ⅰ型)，F(xiàn)OXA1和(或)CK20至少一項(xiàng)為陽性(+/)，而CK14、CK5/6、CD44均(-)，共73例；另一組是腔面為主型(Ⅱ型)，F(xiàn)OXA1和(或)CK20至少一項(xiàng)為()，CK14、CK5/6、CD44不超過一項(xiàng)陽性，且陽性細(xì)胞數(shù)不超過(+)，共32例。同樣將基底樣型癌也分為兩組，一組是純基底樣癌(Ⅲ型)，CK14、CK5/6、CD44至少一項(xiàng)為陽性(+/)，F(xiàn)OXA1和CK20均(-)，共56例；另一組為基底為主型癌(Ⅳ型)，CK14、CK5/6、CD44至少一項(xiàng)為()，腔面型標(biāo)記FOXA1和(或)CK20不超過一項(xiàng)陽性，陽性細(xì)胞數(shù)不超過(+)，共14例。剩余22例為不能分型癌(Ⅴ型)，大多數(shù)(20例)是腔面型和基底樣型標(biāo)記重疊程度超過上述Ⅱ型和Ⅳ型標(biāo)準(zhǔn)；還有少數(shù)是分化很差的癌，上述5項(xiàng)標(biāo)記均陰性，但臨床、組織學(xué)形態(tài)和其它免疫標(biāo)記如CK7、GATA3仍能證實(shí)其為膀胱浸潤性尿路上皮癌(共2例)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：88.8%(175/197)的膀胱浸潤性尿路上皮癌可以用本組設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，用免疫組化法分為腔面型和基底樣型兩大基本類型。部分難以分型癌(Ⅴ型)產(chǎn)生的原因可能有一部分癌在分子水平就有腔面型癌和基底樣型癌的交叉重疊，因此在免疫表型上也產(chǎn)生重疊，而這一推測(cè)要通過基因檢測(cè)來證實(shí)；另一種可能是本組在選樣上產(chǎn)生的誤差，即有少數(shù)入組病例可能屬于T1期非肌層浸潤癌。

文獻(xiàn)報(bào)道膀胱浸潤性尿路上皮癌不同組織學(xué)變異與分子分型有一定的相關(guān)性[6-7]。以本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果來看，腺樣、微乳頭、漿細(xì)胞樣和巢狀變異的癌明顯以腔面型癌為主，尤其是前兩種亞型，占比>75%，而鱗樣、肉瘤樣變異的癌則以基底樣型癌為主，占比>85%，這與基底樣型癌容易發(fā)生鱗化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物學(xué)特征有關(guān)。本研究結(jié)果提示膀胱尿路上皮癌的組織學(xué)變異與分子分型有明顯相關(guān)性，其特殊的組織學(xué)變異可以提示其分子分型。

應(yīng)用免疫組化方法對(duì)浸潤性乳腺癌進(jìn)行分子分型，對(duì)臨床采用內(nèi)分泌治療、靶向治療還是化療有直接指導(dǎo)意義，而膀胱浸潤性尿路上皮癌的分子分型尚處于研究之中，其臨床意義還不能與乳腺癌相比。目前已有文獻(xiàn)提出，不同分子分型對(duì)PD-L1免疫治療和化療的敏感性有差異[15-16]。本組結(jié)果發(fā)現(xiàn)以鱗樣、肉瘤樣變異為主的基底樣型癌復(fù)發(fā)率略高，侵襲性略強(qiáng)，提示基于免疫組化方法的分子分型可能有助于臨床治療方案的選擇。目前就國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院病理科來說，對(duì)浸潤性尿路上皮癌進(jìn)行基因突變、易位融合、DNA和RNA測(cè)序等全方位檢測(cè)是無力實(shí)現(xiàn)的，也缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。

綜上，本文根據(jù)197例膀胱浸潤性尿路上皮癌的常規(guī)免疫標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，提出了一種基于免疫組化方法的分子分型標(biāo)準(zhǔn)，可以在對(duì)膀胱浸潤性尿路上皮癌作病理診斷的同時(shí)，又對(duì)其可能的分子分型(屬于腔面型還是基底樣型)作出初步分析，是一種簡便、可重復(fù)的方法。