人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的制備工藝1)

柴艷敏 陳寧 張紫微 周婉梅 鄭威

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150076)

人參是名貴藥材，主要含有人參皂苷、人參多糖等活性成分，廣泛用于多種疾病的治療[1]。人參皂苷Rg1屬四環(huán)三萜類皂苷，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力、保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用[2-7]。人參皂苷Rg1應(yīng)用的研究，較多集中于改善認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力、抑制阿爾茨海默病β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積方面的研究。由于人參皂苷Rg1具有多靶點(diǎn)、毒性低等優(yōu)勢，可以降低活性氧(ROS)的過多積累，保護(hù)神經(jīng)元，能有效抑制乙酰膽堿水解酶(AchE)活性的能力，進(jìn)而減少β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，提高阿爾茨海默癥(AD)小鼠學(xué)習(xí)與記憶的能力，發(fā)揮抗阿爾茨海默癥的作用[8-10]。人參皂苷Rg1是一種包含親脂性類固醇骨架和親水性糖環(huán)的固醇類化合物，水溶性欠佳、親水性糖環(huán)易發(fā)生水解、穩(wěn)定性差，影響了其治療效果。但是，關(guān)于人參皂苷Rg1水溶性的納米顆粒制備的研究較少。

羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)屬環(huán)糊精衍生物，內(nèi)部筒狀空腔結(jié)構(gòu)，具有水溶性好、安全性高等特點(diǎn)，是優(yōu)選的包合壁材，作為藥物輔料在藥劑學(xué)方面已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用[11]。為此，本研究以人參皂苷Rg1為原料、羥丙基-β-環(huán)糊精為載體、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，制備人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒；應(yīng)用紅外光譜、掃描電鏡、X射線衍射、熱質(zhì)量分析、體外緩釋試驗(yàn)，對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒進(jìn)行表征；旨在為人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒制備工藝參數(shù)的優(yōu)選提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

材料：人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品、人參皂苷Rg1(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>90%)、羥丙基-β-環(huán)糊精(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)，由上海源葉生物科技有限公司購入；超純水、無水乙醇。

儀器與設(shè)備：紫外-可見光分光光度計UV-2600(島津儀器有限公司)、ZetaPALS激光粒度儀(美國布魯克海文儀器公司)、IRAffinity-1傅里葉變換紅外色譜(FTIR，日本島津公司)、1525高效液相色譜儀(HPLC，WATERS)、NETZ5CH熱質(zhì)量分析儀(德國耐馳)。

人參皂苷Rg1納米顆粒制備方法：參照文獻(xiàn)[12]精密稱取一定量羥丙基-β-環(huán)糊精，加入一定體積的超純水，60 ℃溶解后冷卻至所需溫度；另取一定質(zhì)量的人參皂苷Rg1，用適量的無水乙醇溶解，超聲后用有機(jī)濾膜過濾，將人參皂苷Rg1乙醇溶液緩慢滴加到羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中，恒溫下磁力攪拌一定時間，負(fù)壓旋蒸除去乙醇，冷凍干燥，制得人參皂苷Rg1納米顆粒，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

單因素試驗(yàn)設(shè)計：以人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的粒徑為評價指標(biāo)，分析m(人參皂苷Rg1)∶V(水)、m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、攪拌速度對粒徑的影響。

正交試驗(yàn)設(shè)計[11]：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的粒徑為評價指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(L9(34))對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒制備工藝進(jìn)行優(yōu)化；各工藝參數(shù)設(shè)計3個梯度(見表1)，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

表1 人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒制備工藝參數(shù)遴選的梯度設(shè)計

人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒樣品中人參皂苷Rg1質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：借鑒文獻(xiàn)[13]～[15]，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 g·L-1)稀釋成不同的質(zhì)量濃度，采用1525高效液相色譜儀檢測，檢測波長為203 nm；色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、流動相為V(乙腈)∶V(水)=1∶4、流速為1 mL·min-1、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量10 μL、保留時間36 min。人參皂苷Rg1回歸方程為Y=3×106x-112 555(R2=0.999 7，n=8)，式中的Y為峰面積，x為人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度。通過人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及保留時間，計算出人參皂苷Rg1在人參皂苷Rg1顆粒中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

羥丙基-β-環(huán)糊精對人參皂苷Rg1包合效果檢測方法：應(yīng)用紅外光譜、X射線衍射分析法進(jìn)行羥丙基-β-環(huán)糊精對人參皂苷Rg1包合效果檢測。紅外光譜檢測的掃描波長范圍為400～4 000 cm-1，分別稱取200 mg溴化鉀樣品、2.0 mg人參皂苷Rg1、2.0 mg羥丙基-β-環(huán)糊精、2.0 mg人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒，混勻研磨壓片進(jìn)行檢測，以溴化鉀作空白對照。在檢測范圍5°～90°、速度5°·min-1，將這3種樣品放到具有轉(zhuǎn)動探頭的X射線衍射儀上(飛利浦，荷蘭)，進(jìn)行分析。

人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒熱穩(wěn)定性分析方法：應(yīng)用熱質(zhì)量分析方法分析人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒熱穩(wěn)定性。分別稱取20～25 mg人參皂苷Rg1、羥丙基-β-環(huán)糊精、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒放在氧化鋁坩堝，氮?dú)鈿夥?，加熱溫度?0～800 ℃，升溫速率為10 ℃·min-1；以空坩堝作為基線，對3種樣品的熱分解規(guī)律進(jìn)行檢測。

3種樣品的表面形態(tài)觀察方法：將人參皂苷Rg1、羥丙基-β-環(huán)糊精、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒真空鍍金后，通過電子顯微鏡(MX2600FE，Camscan，UK)掃描，觀察3種樣品的表面形態(tài)特征。

人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒體外釋放量檢測方法：借鑒文獻(xiàn)[16]，以濃度為0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖鹽溶液為溶出介質(zhì)，將人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒樣品分別放置在透析袋中，分別在設(shè)定的時間取樣，通過紫外光光度計對樣品溶液中人參皂苷Rg1釋放量進(jìn)行檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑的影響

m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑的影響：當(dāng)其他因素固定(m(人參皂苷Rg1)∶V(水)為1 g∶20 mL、反應(yīng)溫度25 ℃、反應(yīng)時間45 min、攪拌速度1 200 r·min-1)，不同m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)時(1 g∶1 g、2 g∶1 g、3 g∶1 g、4 g∶1 g、5 g∶1 g)，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑分別為(1 019±37)、(622±25)、(496±23)、(401±21)、(406±22)nm；隨著羥丙基-β-環(huán)糊精用量的增大，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑呈現(xiàn)先急劇降低，而當(dāng)羥丙基-β-環(huán)糊精用量比超過4 g∶1 g時，趨于平緩。因此，選擇m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)為4 g∶1 g。

m(人參皂苷Rg1)∶V(水)對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑的影響：當(dāng)其他因素固定(m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)為4 g∶1 g、反應(yīng)溫度25 ℃、反應(yīng)時間45 min、攪拌速度1 200 r·min-1)，不同m(人參皂苷Rg1)∶V(水)時(1 g∶5 mL、1 g∶10 mL、1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL)，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑分別為(867±34)、(582±23)、(399±21)、(376±22)、(385±20)nm。隨著m(人參皂苷Rg1)∶V(水)的增大，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑呈現(xiàn)趨勢為先急劇降低后趨于平緩；當(dāng)m(人參皂苷Rg1)∶V(水)高于1 g∶20 mL時，降低幅度不大，過大的m(人參皂苷Rg1)∶V(水)會使后續(xù)處理的能耗增加。因此，m(人參皂苷Rg1)∶V(水)確定為1 g∶20 mL。

反應(yīng)溫度對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑的影響：當(dāng)其他因素固定(m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)為4 g∶1 g、m(人參皂苷Rg1)∶V(水)為1 g∶20 mL、反應(yīng)時間45 min、攪拌速度1 200 r·min-1)，不同反應(yīng)溫度時(25、40、55、70、85 ℃)，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑分別為(365±20)、(376±23)、(391±21)、(382±22)、(362±21)nm。當(dāng)反應(yīng)溫度在25～55 ℃時，隨著溫度升高，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，這主要是因?yàn)闇囟容^高使其團(tuán)聚；當(dāng)反應(yīng)溫度高于55 ℃時，隨著溫度的升高，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這主要是因?yàn)楦邷厥挂掖紦]發(fā)，有利于其形成；但低溫條件更有利于制備，因此，反應(yīng)溫度設(shè)置為25 ℃。

反應(yīng)時間對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑的影響：當(dāng)其他因素固定(m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)為4 g∶1 g、m(人參皂苷Rg1)∶V(水)為1 g∶20 mL、反應(yīng)溫度25 ℃、攪拌速度1 200 r·min-1)，不同反應(yīng)時間時(15、30、45、60、90 min)，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑分別為(454±21)、(416±20)、(387±22)、(643±25)、(829±31)nm。人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑呈現(xiàn)先逐漸降低、后增加的趨勢，這主要是因?yàn)殡S著反應(yīng)時間延長而使人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒團(tuán)聚。因此，反應(yīng)時間選定為45 min。

攪拌速度對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑的影響：當(dāng)其他因素固定(m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)為4 g∶1 g、m(人參皂苷Rg1)∶V(水)為1 g∶20 mL、反應(yīng)溫度25 ℃、反應(yīng)時間45 min)，不同攪拌速度時(400、800、1 200、1 600、2 000 r·min-1)，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑分別為(1 724±39)、(826±33)、(397±22)、(406±21)、(421±22)nm。隨著攪拌速度的增加，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑呈現(xiàn)先急劇降低、后緩慢增加的趨勢。這主要是因?yàn)槌浞值臄嚢栌欣诩{米顆粒子形成和分散，當(dāng)攪拌速度過高時，人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒團(tuán)聚作用增加。因此，最優(yōu)攪拌速度為1 200 r·min-1。

2.2 人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒制備工藝參數(shù)遴選

本研究按照三因素三水平設(shè)計正交試驗(yàn)，遴選人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒制備工藝參數(shù)。按照試驗(yàn)方案(L9(34))，9組試驗(yàn)結(jié)果的人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑分別為(786±24)、(516±27)、(559±29)、(492±22)、(441±23)、(460±26)、(588±31)、(472±32)、(410±28)nm；對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析(見表2)、方差分析(見表3)。由表2、表3可見：3個因素對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒粒徑的影響，由大到小依次為m(人參皂苷Rg1)∶V(水)(因素A)、m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)(因素B)、反應(yīng)時間(因素C)；人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒最佳制備工藝為A2B2C2(m(人參皂苷Rg1)∶V(水)為1 g∶20 mL，m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)為4 g∶1 g，反應(yīng)時間為45 min)。在此條件下，3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)獲得平均粒徑為(405±20)nm、人參皂苷Rg1平均包合率為(87.95±3.41)%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的各因素不同梯度的均值及極差

表3 正交試驗(yàn)中各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性

2.3 人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒性能

由圖1可見：人參皂苷Rg1原料為淡黃色塊狀粉末，而人參皂苷Rg1水溶性納米粉為均勻乳白色粉末。由掃描電子顯微鏡掃描結(jié)果(見圖C)可見，人參皂苷Rg1水溶性納米粉呈不規(guī)則簇狀，表面形態(tài)為結(jié)構(gòu)松散的短棒狀納米顆粒，顆粒之間縫隙明顯，說明其具有較大的比表面積，水溶解性能得到較明顯提高。

A為人參皂苷Rg1原料照片；B為人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒照片；C為人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的掃描電子顯微鏡掃描圖。

人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的熱穩(wěn)定性：物質(zhì)熱解過程通常分為3個階段[17]，差熱質(zhì)量分析法曲線的峰值表示該溫度下樣品的最大質(zhì)量損失。人參皂苷Rg1原料、羥丙基-β-環(huán)糊精、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒熱質(zhì)量分析表明：在200～220 ℃處，人參皂苷Rg1有明顯的低相對分子質(zhì)量組分熱解峰，并且在300～390 ℃處還有較寬的高相對分子質(zhì)量組分熱解峰；而羥丙基-β-環(huán)糊精，在350 ℃附近只有1個明顯的高相對分子質(zhì)量組分熱解峰；人參皂苷Rg1水溶性納米粉，不僅在230 ℃附近有低相對分子質(zhì)量組分熱解峰，在345 ℃附近還有1個明顯的高相對分子質(zhì)量組分熱解峰；說明人參皂苷Rg1和羥丙基-β-環(huán)糊精，可以通過實(shí)驗(yàn)方法很好地形成人參皂苷Rg1水溶性納米粉。

羥丙基-β-環(huán)糊精對人參皂苷Rg1的包合效果：①經(jīng)人參皂苷Rg1水溶性納米粉、原料及羥丙基-β-環(huán)糊精紅外譜圖分析，在3 266 cm-1處人參皂苷Rg1有較強(qiáng)的羥基伸縮振動吸收峰，羥丙基-β-環(huán)糊精也有此現(xiàn)象，而人參皂苷Rg1水溶性納米粉的羥基伸縮振動吸收峰則明顯減弱；這表明人參皂苷Rg1和羥丙基-β-環(huán)糊精之間，通過氫鍵締合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的人參皂苷Rg1水溶性納米粉。在2 982、2 853 cm-1處為甲基和亞甲基振動吸收峰；在1 692 cm-1處為羰基(—CO)伸縮振動峰；此外，位于935 cm-1處吸收峰，代表雙鍵上的—CH平面外變形振動。人參皂苷Rg1水溶性納米粉的譜圖和羥丙基-β-環(huán)糊精的吸收光譜相似，也說明羥丙基-β-環(huán)糊精對人參皂苷Rg1形成了很好的納米包合作用。②羥丙基-β-環(huán)糊精、人參皂苷Rg1原料、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的X射線衍射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羥丙基-β-環(huán)糊精和人參皂苷Rg1水溶性納米粉有2個相似的X射線衍射峰，分別在衍射角11°、18°有衍射峰出現(xiàn)。人參皂苷Rg1水溶性納米粉的峰型，沒有羥丙基-β-環(huán)糊精的峰型尖銳，其中人參皂苷Rg1的特征峰消失，而人參皂苷Rg1在衍射角17°左右有尖銳的衍射峰。這些都說明，羥丙基-β-環(huán)糊精對人參皂苷Rg1進(jìn)行了很好的包合，形成結(jié)構(gòu)均一的人參皂苷Rg1水溶性納米粉。

人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒體外溶出性能：依據(jù)2020年版《中國藥典》測定溶出度。稱取一定質(zhì)量的人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒、人參皂苷Rg1，以pH為6.8的磷酸鹽緩沖液為溶媒，配置釋放溶液體系，溶液溫度控制在(37.0±0.5)℃范圍，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，按照預(yù)定時間分別吸取這兩種樣品溶液5.0 mL，并補(bǔ)充等體積新鮮的磷酸鹽緩沖液到溶液體系，以便保持溶液總體積不變。用0.45 μm微孔濾膜濾過后，參照高效液相色譜法測定峰面積，計算人參皂苷Rg1溶出度(見表4)。由表4可見：人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒、人參皂苷Rg1在溶解25 min時的溶出率，分別達(dá)到了90.88%、58.42%，具有顯著差異性；表明人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的溶出更迅速、水溶性更好、生物活性更佳。

表4 人參皂苷Rg1水溶性納米粉和人參皂苷Rg1原料體外溶出時效

3 結(jié)論

本研究以人參皂苷Rg1為原料、羥丙基-β-環(huán)糊精為載體、人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒的粒徑為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并獲得最優(yōu)制備工藝(m(人參皂苷Rg1)∶V(水)為1 g∶20 mL、m(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶m(人參皂苷Rg1)為4 g∶1 g、反應(yīng)溫度為25 ℃、反應(yīng)時間為45 min)。通過驗(yàn)證試驗(yàn)獲得平均粒徑為(405±20)nm的人參皂苷Rg1水溶性納米顆粒，具有良好的水溶性和體外釋放能力。本研究為難溶性的人參皂苷開發(fā)和利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，將為一些退行性神經(jīng)疾病治療藥物的開發(fā)提供參考，也為人參皂苷Rg1廣泛的應(yīng)用前景提供支持。