低共熔溶劑修飾分子印跡聚合物分離刺五加中的刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶1)

李京都 李俊含 劉子晴 胡雙羽 馬春慧

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

藥用植物的綠色提取與高純度分離一直是我國林木資源高效可持續(xù)開發(fā)的1個重要研究課題。近年來，我國林源提取物的相關(guān)研究與生產(chǎn)均取得迅猛發(fā)展，但分離技術(shù)創(chuàng)新仍是當(dāng)前該領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)。具有選擇性識別特點的分子印跡技術(shù)近年來在分離植物活性成分、模擬催化反應(yīng)酶技術(shù)、固相萃取、生化傳感器、色譜分離等領(lǐng)域顯示出很大潛力[1-2]。分子印跡技術(shù)(MIT)的原理[3](圖1)是通過將官能團的模板及單體進(jìn)行自組裝，再經(jīng)共聚合過程形成具有特殊結(jié)合位點的分子印跡聚合物(MIP)，從而在遇到其他類似結(jié)構(gòu)時，可以高效地、選擇性地結(jié)合模板分子。這一專屬性識別技能可在分離過程中大大提高活性成分的純度，為后續(xù)藥物加工活合成提供純度更高的中間體，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。而低共熔溶劑(DES)由于其低毒性和高生物降解性被用于修飾一些功能化的材料表面或作為致孔劑、修飾劑應(yīng)用到分子印跡聚合物的合成中，經(jīng)低共熔溶劑修飾后的分子印跡聚合物的孔狀結(jié)構(gòu)分布與大小都有很大改善[4]。因此，本研究嘗試以甲基丙烯酸(MAA)和具有高生物相容性的低共熔溶劑作為雙功能單體，合成了三分子模板的分子印跡聚合物，并聯(lián)合固相萃取、技術(shù)分離刺五加提取液中刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶3種成分。由于低共熔溶劑的加入不但提高了對模板分子的專屬性識別能力及刺五加有效成分的純度，同時改善了分子印跡聚合物在水相介質(zhì)中相容性不好的弊端，使吸附在水相中進(jìn)行。

圖1 分子印跡技術(shù)原理示意圖

低共熔溶劑是Abbott et al.[5]在2003年報道的一種新型綠色溶劑，具有制備簡單、價格便宜、生物可降解、能夠提高有機反應(yīng)效率等特點[6-7]。已在分離天然產(chǎn)物的領(lǐng)域應(yīng)用，如低共熔溶劑對黃芩苷[8]、酚類化合物[9]均表現(xiàn)出良好的提取效果。本研究的目標(biāo)化合物刺五加苷類及異嗪皮啶由于化學(xué)極性相差較大，傳統(tǒng)的有機溶劑體系很難同時萃取二者，因此嘗試采用同為水相的低共熔溶劑并配合微波輔助法[10]提取刺五加有效成分。不但克服了現(xiàn)有方法——溶劑回流法，加熱時間較長，提取效率較低，且所用溶劑量大、毒性較強、污染環(huán)境等弊端；還避免了由于操作溫度過高，時間加長而破壞其有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)[11]。

本研究以東北地區(qū)道地藥材刺五加(Acanthopanaxsentcosus(Ruper. et Maxim.) Harms)干燥根莖為原料[12-13]，通過微波輔助低共熔溶劑溶液提取刺五加苷B[14-18](紫丁香苷，圖2A)、刺五加苷E[19-20](紫丁香樹脂酚葡萄糖苷，圖2B)、異嗪皮啶[21-22](7-羥基-6,8-二甲基香豆素，圖2C)。采用三分子模板的分子印跡技術(shù)聯(lián)合固相萃取技術(shù)分離刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶3種目標(biāo)產(chǎn)物，提高其純度和回收率。

圖2 刺五加苷B(A)、刺五加苷E(B)和異嗪皮啶(C)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗原料為刺五加干燥根莖，產(chǎn)自黑龍江地區(qū)，于2018年10月購自黑龍江省哈爾濱市三棵樹藥材市場，粉碎至60～80目待用。刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶對照品購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；聚苯乙烯二乙烯苯樹脂微球購自上海樊克生物科技有限公司，純度為1%；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

試驗儀器及設(shè)備為ZNCL-GS(190*90)磁力數(shù)顯加熱鍋攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、XH-100A微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)、DZ-1BCⅣ型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、3K-30超速離心機(美國SIGMA公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶的測定方法

本試驗采用HPLC法定量測定刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶。精確稱取10.0 mg的刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶的標(biāo)準(zhǔn)品放入10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，混合均勻后得到質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為對照品儲備溶液。然后從中取出5 mL的儲備溶液放入另一個10 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，制成質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以此類推，分別制出質(zhì)量濃度為1 000.000 0、500.000 0、250.000 0、125.000 0、62.500 0、31.250 0、15.625 0、7.812 5 mg·L-1的刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶對照品的溶液，用一次性的注射器(5 mL)將配好的標(biāo)準(zhǔn)溶液通過0.22 μm濾膜過濾，保存在1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行HPLC檢測分析。刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶的檢測波長分別為220、206、344 nm。

樣品測試與標(biāo)準(zhǔn)品的測試方法相同，用一次性的注射器(5 mL)將樣品的提取液通過0.22 μm濾膜過濾，保存在1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行測定，分析結(jié)束后，記錄刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶對應(yīng)的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得質(zhì)量濃度。

1.2.2 低共熔溶劑的制備

試驗前將具有強吸水性的氯化膽堿(ChCl)于80 ℃的真空干燥箱內(nèi)干燥24 h。將氯化膽堿和乙二醇(EG)按一定摩爾比配制，并倒入圓底燒瓶中，80 ℃油浴內(nèi)磁力攪拌10 min，最終變成無色透明的液體，冷卻得到氯化膽堿-乙二醇低共熔溶劑。稱氯化膽堿和丙三醇(GI)、氯化膽堿和1,4-丁二醇(BDO)分別制取氯化膽堿-丙三醇、氯化膽堿-1,4-丁二醇低共熔溶劑。在使用前按照含水率加入相應(yīng)體積的水，以體積比配制低共熔溶劑溶液作為提取液。

1.2.3 微波輔助萃取法

將2.0 g干燥的刺五加原料放入三口燒瓶內(nèi)，加入20 mL低共熔溶劑(n(氯化膽堿)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化膽堿-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5)，放入微波裝置中輻射10 min，設(shè)定微波功率為400 W，萃取后冷卻至室溫，過濾，取上層清液，經(jīng)0.22 μm的濾膜濾入1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶，液相檢測刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶質(zhì)量濃度，計算得率并在-20 ℃下保存。

1.2.4低共熔溶劑微波輔助萃取刺五加苷B、刺五加苷E和異嗪皮啶單因素試驗

按照微波輔助萃取法進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗，確定出最佳的低共熔鹽組分及其摩爾比、低共熔溶劑的溶液比和萃取的料液比，然后再對微波的功率及動力學(xué)進(jìn)行研究，確定出最佳的微波功率及微波時間，以刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶的提取率為響應(yīng)值，得出最優(yōu)的單因素試驗條件。

1.2.5 雜化分子印跡聚合物的合成

稱取37.24 mg刺五加苷B，74.27 mg刺五加苷E，22.22 mg異嗪皮啶的標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL具塞錐形瓶中，加入0.042 2 mL甲基丙烯酸(MAA)和0.25 mL低共熔溶劑(n(氯化膽堿)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化膽堿-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5)，經(jīng)10 mL乙腈溶液溶解，再加入1.00 g聚苯乙烯-二乙烯苯(PS-DVB)樹脂，超聲10 min，使混合物均勻分散并溶解，然后在室溫下預(yù)聚合2 h；加入17.28 mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)和0.204 2 mL交聯(lián)劑雙甲基丙烯酸乙二醇脂(EDMA)，超聲10 min使其混合均勻，通N2除氧20 min，密封處理，放入60 ℃油浴振蕩器內(nèi)，在200 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩聚合24 h。以甲醇-乙酸為洗脫液，V(甲醇)∶V(乙酸)=80∶20，超聲洗脫模板分子及未反應(yīng)的功能單體、引發(fā)劑、交聯(lián)劑，至無模板物質(zhì)，再用甲醇洗至中性。于60 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥24 h，制得三模板分子印跡聚合物。用同樣的方法制備出相應(yīng)的無模板聚合物(NIP)。

1.2.6 吸附性實驗試驗表征

對于靜態(tài)吸附試驗，取50 mg三模板分子印跡聚合物與相應(yīng)的無模板聚合物，各放進(jìn)3個試管中，分別向其中加入1.0 mL含有刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的不同質(zhì)量濃度(100.0、200.0、300.0、400.0、500.0 mg·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)液。室溫下，將固液混合體系置于振蕩器中振搖5 h，而后5 000 r/min離心，取上清液進(jìn)行液相檢測。

對于動態(tài)吸附試驗，方式同靜態(tài)吸附試驗，但分析物的質(zhì)量濃度為固定值(刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶均為150.0 mg·L-1)，且在不同的時間(10、20、40、60、80、100、120 min)進(jìn)行測試。

1.2.7 分子印跡聚合物吸附刺五加提取液

將干燥的刺五加原料按單因素試驗中得到的最佳試驗條件進(jìn)行微波輔助提取，得到刺五加提取液。用乙腈復(fù)溶，定容至5 mL。分別稱取200 mg分子印跡聚合物及無模板聚合物，填充到空的固相萃取(SPE)柱內(nèi)，兩端加入篩板以防止吸附劑流失。填充完制取的填料后，每個固相萃取小柱分別用1.0 mL甲醇溶液和3.0 mL去離子水沖洗柱子。將1.0 mL刺五加提取液流經(jīng)固相萃取柱，1.0 mL去離子水用作淋洗液，2.0 mL甲醇用作洗脫液，將1.0 mL的注射器置于固相萃取柱的底端，在保證穩(wěn)定的流速的前提下收集每步?jīng)_洗出的液體，收集出的液體用于下一步的HPLC檢測。

1.2.8 淋洗液和洗脫液的優(yōu)化試驗

為了得到較高的固相萃取回收率，按固相萃取的方法分別對分子印跡聚合物-固相萃取柱過程中的淋洗液及洗脫液的種類、用量進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步考察了固相萃取柱的選擇性及可實用性。依次加入1.5 mL甲醇和1.5 mL水對固相萃取柱進(jìn)行沖洗活化，然后加入1.0 mL刺五加提取液至固相萃取柱。接著加入1.0 mL不同的淋洗液(乙腈；水；乙醇；丙酮；甲醇)到固相萃取柱管中，收集淋洗液，經(jīng)HPLC計算出損失率，選擇淋洗液后再對淋洗液體積進(jìn)行優(yōu)化。

選用造成的損失較低的淋洗液進(jìn)行淋洗，再進(jìn)行洗脫。分別對5種不同的洗脫液：V(乙腈)∶V(乙酸)=95∶5、V(水)∶V(乙酸)=95∶5、V(乙醇)∶V(乙酸)=95∶5、V(丙酮)∶V(乙酸)=95∶5、V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5進(jìn)行對比優(yōu)化，各取2.0 mL洗脫液加入到固相萃取管柱中，對吸附的目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，收集固相萃取柱流出液經(jīng)HPLC計算出回收率，最后對所選出的洗脫液體積進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測定刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶

分別取刺五加苷B(0.125 g·L-1)、刺五加苷E(0.250 g·L-1)、異嗪皮啶(0.250 g·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣5 μL，測定結(jié)果見圖3，其中刺五加苷B(圖3c)的保留時間為3.8 min，刺五加苷E(圖3b)的保留時間為7.7 min，異嗪皮啶(圖3a)的保留時間為19.2 min。

圖3 異嗪皮啶、刺五加苷E、刺五加苷B的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

采用同樣的測定方法，提取液中的異嗪皮啶、刺五加苷E、苷B的色譜出峰情況分別如圖4所示，說明本試驗采取的液相條件能夠很好的分離本次提取的有效成分。從圖中可以看出，刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶依次出峰，所有樣品在20 min內(nèi)出峰完畢。對比標(biāo)準(zhǔn)樣品和提取液中的刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的色譜出峰情況，發(fā)現(xiàn)提取液中的異嗪皮啶與刺五加苷E出峰時間早于標(biāo)準(zhǔn)品，通過對二者進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法，確定圖4a中的1號峰和圖4b中的2號峰分別為異嗪皮啶、刺五加苷E。

圖4 刺五加樣品色譜圖

2.2 刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

用HPLC法檢測后，以刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗

2.3.1 低共熔鹽組分的確定

將干燥后的氯化膽堿(氫鍵受體)與乙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇(氫鍵供體)分別以相同的摩爾比(1∶3)混合后，在80 ℃的油浴內(nèi)加熱10 min，最終獲得透明低共熔溶劑。然后，加水以保持V(低共熔溶劑)∶V(H2O)=7∶3。稱取1.0 g刺五加原料置于三口燒瓶內(nèi)，加入制備好的低共熔溶劑，使料液比為m(刺五加根莖粉末)∶V(低共熔溶劑水溶液)=1 g∶10 mL。室溫下浸泡2 h，放入微波裝置中輻射10 min，設(shè)定微波功率為300 W，萃取后進(jìn)行過濾，并取上層清液，此時溶液呈現(xiàn)淡黃色，冷卻后經(jīng)0.22 μm的濾膜濾入1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶，液相檢測刺五加苷B、苷E及異嗪皮啶的質(zhì)量濃度，計算得率并在-20 ℃下保存。

結(jié)果如表2所示，氯化膽堿和乙二醇混合后對刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的萃取效果均為最佳，因此，選擇乙二醇作為氫鍵供體配制本試驗所需的低共熔溶劑。

表2 不同低共熔溶劑對刺五加苷B、苷E和異嗪皮啶提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3.2 低共熔鹽組分摩爾比的優(yōu)化

氫鍵供體得以確定后，將氯化膽堿和乙二醇按不同的摩爾比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)混合，在80 ℃的油浴內(nèi)加熱10 min，最終獲得透明液體低共熔溶劑。然后，加水以保持V(低共熔溶劑)∶V(H2O)=7∶3。稱取1.0 g的原料置于三口燒瓶內(nèi)，以料液比為m(刺五加根莖粉末)∶V(低共熔溶劑水溶液)=1 g∶10 mL加入制備好的低共熔溶劑，室溫下浸泡2 h，放入微波裝置中輻射10 min，設(shè)定微波功率為300 W，萃取后進(jìn)行過濾，并取上層清液，溶液呈現(xiàn)出淡黃色，冷卻后經(jīng)0.22 μm的濾膜濾入1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶，液相檢測刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶質(zhì)量濃度，計算得率并在-20 ℃保存。

檢測結(jié)果如表3所示，異嗪皮啶及刺五加苷B的提取量隨乙二醇比例的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，氯化膽堿與乙二醇摩爾比為1∶3時提取量最高；摩爾比為1∶2時對刺五加苷E的萃取效果最好。綜合考慮，選擇n(氯化膽堿)∶n(乙二醇)=1∶3為低共熔溶劑的最佳配比。

表3 不同摩爾比的低共熔溶劑對刺五加苷B、苷E和異嗪皮啶提取量的影響

2.3.3 溶液比的優(yōu)化

將n(氯化膽堿)∶n(乙二醇)=1∶3混合后在80 ℃油浴內(nèi)加熱10 min，獲得透明液體低共熔溶劑。然后，加水保持V(低共熔溶劑)∶V(H2O)分別為4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2。稱取1.0 g的原料置于三口燒瓶內(nèi)，以m(刺五加根莖粉末)∶V(低共熔溶劑水溶液)=1 g∶10 mL加入制備好的低共熔溶劑，室溫下浸泡2 h，放入微波裝置中輻射10 min，設(shè)定微波功率為300 W，萃取后進(jìn)行過濾，并取上層清液，冷卻后經(jīng)0.22 μm的濾膜濾入1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶，液相檢測刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶質(zhì)量濃度，計算得率并在-20 ℃下保存。

低共熔溶劑是由氫鍵供體與氫鍵受體組成，作為溶劑提取天然產(chǎn)物時可提供氫鍵，增加有效物質(zhì)的溶出。但由于低共熔溶劑黏度大，湍動性與穿透力均不佳，不能直接作為提取溶劑與物料接觸，其會影響植物細(xì)胞壁表面的通透性，從而阻礙有效物質(zhì)的溶出，需要與水配制成溶液而作為提取溶劑。然而，水量的增加導(dǎo)致溶劑化學(xué)極性的迅速增加，根據(jù)“相似相溶”原理，極性過大對于極性相對較小的刺五加天然產(chǎn)物溶解度有限，所以低共熔溶液中的含水量對于提取結(jié)果至關(guān)重要。試驗結(jié)果如圖5所示，當(dāng)?shù)凸踩廴軇┡c水的體積比為5∶5(也就是體積分?jǐn)?shù)為50%)時，刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的提取量均達(dá)到最大值，水的加入使溶劑的黏度下降，穿透細(xì)胞壁滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部的能力增強，使刺五加苷和異嗪皮啶迅速溶出。而后，刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的提取量隨低共熔溶劑與水的體積比的增大而減小，是因為隨著水量的加大，溶出的有效成分的溶解能力下降，因而選擇V(低共熔溶劑)∶V(H2O)=5∶5為最佳溶液比。

圖5 不同溶液比對刺五加苷B、E和異嗪皮啶提取量的影響

2.3.4 料液比的優(yōu)化

料液比若過大，會增加回收能耗，且浪費溶劑；而料液比較小，則目標(biāo)成分難以充分且快速的溶出。將1.0 g刺五加原料置于三口燒瓶內(nèi)，按m(刺五加根莖粉末)∶V(低共熔溶劑水溶液)為1 g∶5 mL、1 g∶10 mL、1 g∶15 mL、1 g∶20 mL、1 g∶25 mL分別加入5、10、15、20、25 mL低共熔溶劑(n(氯化膽堿)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化膽堿-乙二醇)∶V(H2O)=7∶3),室溫下浸泡2 h，放入微波裝置中輻射10 min，設(shè)定微波功率為300 W，萃取過后過濾，取上層清液，冷卻后經(jīng)0.22 μm的濾膜濾入1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶，液相檢測刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶質(zhì)量濃度，計算得率并在-20 ℃下保存。

經(jīng)HPLC檢測后結(jié)果如圖6所示，刺五加苷E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在m(刺五加根莖粉末)∶V(低共熔溶劑水溶液)=1 g∶5 mL時最高，而刺五加苷B、異嗪皮啶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨料液比的增大逐漸增大；為了降低溶劑黏度，節(jié)約試驗成本，最終選擇m(刺五加根莖粉末)∶V(低共熔溶劑水溶液)=1 g∶10 mL為最佳料液比。

圖6 不同料液比對刺五加苷B、E和異嗪皮啶提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3.5 微波功率與動力學(xué)研究

不同的微波功率會影響有效活性成分的提取效率。將1.0 g原料置于三口燒瓶內(nèi)，分別加入10 mL低共熔溶劑(n(氯化膽堿)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化膽堿-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5),室溫下浸泡2 h，在不同的微波功率下(300、400、500、600、700 W)萃取10 min，而后過濾取上層清液，冷卻后經(jīng)0.22 μm的濾膜濾入1.5 mL的棕色玻璃進(jìn)樣瓶，液相檢測刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算得率并在-20 ℃下保存。

經(jīng)HPLC檢測后結(jié)果如表4所示，400 W微波功率時，對刺五加苷B、異嗪皮啶的萃取效果較好；500 W時，對刺五加苷E的萃取效果較好。之后，各物質(zhì)的質(zhì)量濃度隨著微波功率的增加而依次減少，為了提高產(chǎn)率并節(jié)約試驗成本，選擇400 W為最優(yōu)微波功率。

表4 不同微波功率對刺五加苷B、E和異嗪皮啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

確定出最優(yōu)功率后，將3.0 g原料置于三口燒瓶內(nèi)，加入30 mL的低共熔溶劑(n(氯化膽堿)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化膽堿-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5),浸泡2 h，于400 W微波功率下，從第6 min起每隔2 min取樣液相檢測刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶質(zhì)量濃度。

經(jīng)HPLC檢測后結(jié)果如圖7所示，刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著微波時間的增加而提高；10 min后，三者的質(zhì)量濃度變化趨于平緩。為了提高產(chǎn)率并節(jié)約試驗成本，選擇10 min為最優(yōu)提取時間。

圖7 不同微波時間對刺五加苷B、E和異嗪皮啶提取量的影響

2.4 微波萃取機理分析

圖8是刺五加原料在最優(yōu)單因素條件下提取前后的掃描電鏡，從圖中可以清晰的看出，提取前(圖8A1、圖8A2、圖8A3)細(xì)胞內(nèi)充滿了有效物質(zhì)，放大至3 000倍(圖8A3)時，可以看到許多完整飽滿的細(xì)胞；提取后(圖8B1、圖8B2、圖8B3)細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)明顯減少，放大至3 000倍(圖8B3)時，細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)已被提取完全，提取效果顯著。

由此可以得出，微波萃取過程中極高的輻射能造成了細(xì)胞由內(nèi)而外的指數(shù)式升溫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含有的水分迅速汽化并產(chǎn)生極大壓力，過高的壓力使得細(xì)胞壁損壞，刺五加表面出現(xiàn)裂孔并逐漸增多，其內(nèi)的有效成分自由流出。因而隨著微波功率的增大，各目標(biāo)成分的萃取質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加(圖8)。由于提取介質(zhì)的捕獲和所含目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度較低，在整個提取系統(tǒng)中形成了由高到低的質(zhì)量濃度梯度，因此，各有效物質(zhì)的萃取質(zhì)量濃度在微波萃取初期增幅較大。另外，微波輻射還產(chǎn)生了電磁場，加速了刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶分子從固體擴散到固-液界面的速率，從而縮短了各有效物質(zhì)的提取時間。因此，圖8B3中難以看到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終有效物質(zhì)快速高效地提取出來。

圖8 刺五加原料提取前(A1、A2、A3)和提取后(B1、B2、B3)的SEM圖

2.5 評估聚合物的吸附性能

為評估分子印跡聚合物、無模板聚合物對3種模板分子的吸附性能，在室溫下進(jìn)行了靜態(tài)、動態(tài)吸附試驗。如圖9A1、圖9B1、圖9C1，靜態(tài)吸附曲線表明了隨著標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度的增加(5.0～500.0 mg·L-1)，各聚合物對刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的吸附量也有所增加。而分子印跡聚合物相比于無模板聚合物具有更高的吸附曲線，顯示出分子印跡聚合物具有更好的親和吸附能力，這表明3種模板分子均成功印跡到聚合物結(jié)構(gòu)里，且分別在質(zhì)量濃度為400.0、400.0、300.0 mg·L-1時基本達(dá)到吸附平衡。如圖9A2、圖9B2、圖9C2的動態(tài)吸附曲線，2種聚合物對3種模板分子的吸附性能不斷提高，分別在80、100、100 min時，分子印跡聚合物對3種模板分子的吸附量達(dá)到最大值。分子印跡聚合物因存在特殊的印跡位點，吸附性能更好。對于無模板聚合物，不存在對3種模板分子特異性吸附，其只靠少量的物理吸附及非特異性吸附，無模板聚合物對模板分子的吸附量較小，且達(dá)到吸附平衡的時間相比較短。

圖9 2種分子印跡聚合物對刺五加苷B、E及異嗪皮啶的靜態(tài)吸附(A1、B1、C1)與動態(tài)吸附(A2、B2、C2)

2.6 分子印跡聚合物-固相萃取過程優(yōu)化

通過測試優(yōu)化分子印跡聚合物-固相萃取過程中淋洗液和洗脫液的種類、用量，用來更好的純化3種目標(biāo)組分并得到較高的回收率。淋洗的作用是去除樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)。通過研究一系列淋洗液(乙腈；水；乙醇；丙酮；甲醇)，結(jié)果如表5所示，當(dāng)加入1.0 mL刺五加提取液，使用1.0 mL淋洗液時，H2O對刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的損失率綜合來看最低，分別為10.8%、17.1%、6.9%，因此選擇H2O作為淋洗液。為了提高純化效果以減少損失率，進(jìn)一步研究了不同體積(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL)的H2O的淋洗效果。淋洗液體積過少則仍有待測物殘留在固相萃取柱中，使得效率降低；體積過多不僅增加了試驗所需時間且會造成模板分子損失量較大。如表6所示，淋洗液H2O的體積從1.00 mL增加到1.25 mL,刺五加苷B的損失率由11.1%大幅提高到21.9%，刺五加苷E的損失率由17.7%升至32.2%，而異嗪皮啶的損失率影響不大。結(jié)果表明，在保證凈化效果的前提下，1.0 mL H2O作為固相萃取淋洗溶劑時，模板分子損失率是可接受的。

表5 淋洗液的種類對刺五加苷B、E和異嗪皮啶損失率的影響

表6 淋洗液的體積對刺五加苷B、E和異嗪皮啶損失率的影響

本研究選用了5種典型的洗脫液V(乙腈)∶V(乙酸)=95∶5、V(水)∶V(乙酸)=95∶5、V(乙醇)∶V(乙酸)=95∶5、V(丙酮)∶V(乙酸)=95∶5、V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5，其中加入少量乙酸用來破壞分析物的分子間氫鍵和吸附劑上的識別位點。為降低前一步淋洗造成的損失，使吸附的3種目標(biāo)組分更有效的洗脫出來，因而先用0.25 mL H2O淋洗，再進(jìn)行洗脫。如表7所示，當(dāng)加入1.0 mL刺五加提取液，使用2.0 mL洗脫液時，V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5相較于其他洗脫液對刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶具有更高的洗脫效率，分別為92.1%、93.6%、87.5%，所以被選用為后續(xù)固相萃取的洗脫溶劑。為了進(jìn)一步增加目標(biāo)組分的回收率，研究了不同體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL)的V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5的洗脫效果。如表8，觀察到體積為2.0 mL甲醇-乙酸洗脫溶劑，洗脫效率趨于穩(wěn)定，刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的回收率分別為92.8%、94.3%、88.4%，因而選擇2.0 mLV(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5作為固相萃取的洗脫溶劑。

表7 洗脫液的種類對刺五加苷B、E和異嗪皮啶回收率的影響

表8 洗脫液的體積對刺五加苷B、E和異嗪皮啶回收率的影響

3 結(jié)論

本研究選擇東北地區(qū)的道地中藥材刺五加根莖為原料，以刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶為共同提取對象，采用低共熔溶劑協(xié)同微波效應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的乙醇回流，將刺五加中苷B、苷E、異嗪皮啶一同萃取出來，通過單因素分析，得出最佳萃取條件為：氯化膽堿、乙二醇組成的低共熔溶劑，二者摩爾比為1∶3，低共熔溶劑與水的體積比為1∶1，提取料液比為m(刺五加根莖粉末)∶V(低共熔溶劑水溶液)=1 g∶10 mL，微波時間10 min，微波功率400 W。在最佳試驗條件下，刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的提取率分別為0.282 0、1.486 0、0.048 5 mg·g-1。以低共熔溶劑與甲基丙烯酸作為雙功能單體，合成了三分子模板印跡聚合物，并制備同時富集刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的固相萃取柱。選用1.0 mL H2O作為淋洗溶劑，刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的損失率分別為10.8%、17.1%、6.9%,選擇2.0 mLV(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5作為洗脫溶劑(此時選用0.25 mL H2O作為淋洗溶劑)，選擇性識別3種目標(biāo)組分，此時刺五加苷B、苷E、異嗪皮啶的回收率分別為92.8%、94.3%、88.4%。本研究為低共熔溶劑微波輔助萃取刺五加中刺五加苷B、刺五加苷E、異嗪皮啶提供了試驗數(shù)據(jù)，并通過對低共熔溶劑用來修飾制備多模板分子印跡聚合物來同時吸附分離目標(biāo)提取物進(jìn)行探究，得到了良好的吸附分離結(jié)果，從而為分子印跡技術(shù)在天然產(chǎn)物萃取方面的應(yīng)用提供了參考。