厚垣孢普可尼亞菌PC7菌株液態(tài)發(fā)酵條件的篩選1)

梁英輝 穆丹 宋瑞清

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)(佳木斯大學)(東北林業(yè)大學)

當前，保護生態(tài)環(huán)境已成為公眾共識，農(nóng)林業(yè)的農(nóng)藥使用追求低毒、低殘留。無害化、無農(nóng)藥殘留一直是生化領(lǐng)域?qū)＜业慕K極目標，因此生物農(nóng)藥成為當前的研究重點[1-2]。厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)作為主要的線蟲生防菌之一，具有較大的生防潛力和廣闊的開發(fā)前景[3]。該菌最顯著的特征是能產(chǎn)生厚垣孢子，厚垣孢子耐受能力很強，易在土壤中存活，雖會侵染植物根部表皮，但對其無致病性[4]。據(jù)報道，厚垣孢普可尼亞菌可以在白花三葉草(Trifoliumrepens)、紫丁香(Syringaoblata)、黑麥草(Loliumperenne)、亞麻(Linumusitatissimum)及其他植物根際中定殖[5-9]，且其在植物病蟲害防治工作中發(fā)揮重要作用，生防效果獲得普遍認同。

目前，厚垣孢普可尼亞菌的生物制劑已被廣泛投入生產(chǎn)和生活，例如以厚垣孢普可尼亞菌為原料的線蟲必克微粒劑及微膠囊的研制[10]。不同厚垣孢普可尼亞菌菌株生長的營養(yǎng)需求和環(huán)境條件存在差異[11]，想要廣泛使用厚垣孢普可尼亞菌控制植物寄生線蟲，首先必須解決的問題是獲得厚垣孢普可尼亞菌高生物量的不同產(chǎn)物。與分生孢子相比，厚垣孢子的產(chǎn)孢難度較高，相關(guān)的研究也比較少。國內(nèi)外學者雖然對該菌的液體、固體培養(yǎng)有一定的研究，但系統(tǒng)化的培養(yǎng)方法還未見報道[12]。由于液體發(fā)酵產(chǎn)物(菌絲和厚垣孢子)可以直接用于生物制劑的加工，故從大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的角度出發(fā)，綜合比較認為液體發(fā)酵培養(yǎng)是提高厚垣孢普可尼亞菌生物量的最佳方法。

廣泛應用厚垣孢普可尼亞菌進行生物防治的首要前提是獲得其高生物量產(chǎn)物，摸清其液態(tài)發(fā)酵條件[13]。生防菌株不同，則生長條件及產(chǎn)孢環(huán)境存在差異[14-17]。本研究探究了培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧量、接菌量對厚垣孢普可尼亞PC7菌株發(fā)酵液生物量的影響，并以此為基礎，獲得菌株P(guān)C7孢子與菌絲體產(chǎn)生的最佳條件，以期為未來大批量工業(yè)化培養(yǎng)厚垣孢普可尼亞菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株厚垣孢普可尼亞菌PC7由英國引進，于東北林業(yè)大學森林微生物實驗室4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基制備

將200.0 g·L-1去皮馬鈴薯汁、20.0 g·L-1葡萄糖、3.0 g·L-1磷酸二氫鉀、1.5 g·L-1硫酸鎂、20.0 g·L-1瓊脂，高壓121 ℃滅菌20 min，室溫貯存[1]，用于制備改良PDA固體培養(yǎng)基。

將200.0 g·L-1去皮馬鈴薯汁、20.0 g·L-1葡萄糖、3.0 g·L-1磷酸二氫鉀、1.5 g·L-1硫酸鎂，高壓121 ℃滅菌20 min，室溫貯存[3]，用于制備改良PD液體培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)與孢子收集

將PC7菌種接種于PDA平板中心，24 ℃培養(yǎng)7 d，產(chǎn)孢后取15 mL雙蒸水洗脫孢子。采用血球計數(shù)器，每個樣品重復計數(shù)10次，將其制備成1×107個·mL-1的懸浮液，于4 ℃保存[18]。

1.3.2 菌株液態(tài)發(fā)酵條件的篩選

每個三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培養(yǎng)液，分別接種1 mL孢子懸浮液，不同溫度(20、22、24、26、28、30 ℃)條件下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，在3、5、7 d進行鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干質(zhì)量，3次重復，以進行最適溫度的篩選。

每個三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培養(yǎng)液，調(diào)配初始pH值為2、4、6、8、10、12、14。各接種1 mL孢子懸浮液，分別在24、30 ℃下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)7 d。鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干質(zhì)量，重復3次，以進行最適初始pH值的篩選。

每個三角瓶(500 mL)中加入PD培養(yǎng)液(100、150、200、250、500 mL)，各接種1 mL孢子懸浮液，分別在24、30 ℃下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，在3、5、7 d進行鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干重，重復3次，以進行最適供氧條件的篩選。

每個三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培養(yǎng)液，分別接入0.05、0.50、1.00、1.50 mL孢子懸浮液，分別在24 ℃、30 ℃下，150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，3、5、7 d進行鏡檢、稱質(zhì)量，并確定菌絲干質(zhì)量，重復3次，以進行最適初始接菌量的篩選。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Excel 2020和SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，運用新復極差法進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適溫度的篩選

不同溫度(20、22、24、26、28、30 ℃)條件下，菌株P(guān)C7的孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量見表1。隨著溫度的升高，PC7產(chǎn)孢數(shù)量隨之增加，26 ℃培養(yǎng)5 d時孢子的最高數(shù)量為20.44×105菌落·mL-1。26 ℃培養(yǎng)至7 d，產(chǎn)孢量為15.22×105菌落·mL-1。28、30 ℃條件下，產(chǎn)孢數(shù)量降低，最低時僅3.55×105菌落·mL-1。可見，26 ℃是利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子的最佳溫度。由表1可知，在溫度為24 ℃情況下培養(yǎng)7 d時，菌絲最大干質(zhì)量為1.706 3 g。因此，如以產(chǎn)孢數(shù)量為生產(chǎn)目標，最適條件為26 ℃培養(yǎng)5 d；以菌絲生產(chǎn)為目標，則最適條件為24 ℃培養(yǎng)7 d。

表1 溫度對產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

2.2 最適初始pH值的篩選

在不同的初始pH條件下，PC7菌株的孢子數(shù)量和菌絲干質(zhì)量見表2。由表2可知，當培養(yǎng)溫度分別為24、26 ℃時，酸性(pH<7)和堿性條件(pH>9)都不利于PC7菌株產(chǎn)生孢子。初始pH值為2時不產(chǎn)生孢子，隨著初始pH值的增加，孢子數(shù)量開始上升，在初始pH值升至8時達到最大值，24、26 ℃時孢子數(shù)量分別為117.0×105、188.0×105菌落·mL-1。因此，24、26 ℃溫度條件下，利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子，最佳的初始pH值均為8，但26 ℃時產(chǎn)孢量遠大于24 ℃的產(chǎn)孢量。該試驗的最適溫度與26 ℃溫度條件是利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子的最佳溫度結(jié)果一致。由此可知，溫度26 ℃、初始pH值為8時，可以提高孢子產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。

表2 初始pH值對產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度分別為24、26 ℃時，菌絲的生物量較為一致。菌絲干質(zhì)量在初始pH值為8時達到最大，分別為1.575 8、1.852 8 g。因此，以菌絲生產(chǎn)為目標，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)時，菌絲生物量受初始pH值影響，最適初始pH值為8。

2.3 最適供氧條件的篩選

在不同的氧氣條件(裝瓶量)，PC7菌株分別在24、26 ℃培養(yǎng)3、5、7 d，其產(chǎn)孢量和菌絲干質(zhì)量見表3。由表3可知，在24 ℃下500 mL三角瓶裝瓶量150 mL，培養(yǎng)至5 d時，產(chǎn)孢量最大，為104.0×105菌落·mL-1。在26 ℃下500 mL三角瓶裝瓶量200 mL，培養(yǎng)至3 d時，產(chǎn)孢量為135.0×105菌落·mL-1；相同條件下培養(yǎng)5 d，達最大產(chǎn)孢量，為232.0×105菌落·mL-1?？梢?，26 ℃時的孢子產(chǎn)量比24 ℃時的孢子產(chǎn)量大得多。結(jié)果表明，PC7菌株培養(yǎng)液在培養(yǎng)溫度為26 ℃、500 mL三角瓶裝瓶量200 mL條件下，培養(yǎng)5 d時，孢子產(chǎn)量達最大值，為最適氧氣條件。

表3 供氧條件對產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度分別為24、26 ℃時，菌絲的生物量較為一致，裝瓶量增多后，菌絲干質(zhì)量持續(xù)加大。24、26 ℃下，500 mL三角瓶裝瓶量150 mL，菌絲干質(zhì)量在培養(yǎng)7 d時達到最大，分別為1.946 2、1.601 2 g。研究還發(fā)現(xiàn)，裝瓶量為200、250 mL培養(yǎng)3、5、7 d時，培養(yǎng)溫度為26 ℃時的菌絲干質(zhì)量低于培養(yǎng)溫度為24 ℃時。由此可知，較低的培養(yǎng)溫度促進菌絲生物量的累積。該試驗的最適溫度與24 ℃溫度條件是利用液體發(fā)酵獲得PC7菌絲的最佳溫度結(jié)果一致。以菌絲生產(chǎn)為目標，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)時，初始裝瓶量影響菌絲生物量，初始裝瓶量增多則產(chǎn)量增高。

2.4 最適接菌量的篩選

不同接菌量條件時，分別在24、26 ℃培養(yǎng)3、5、7 d，PC7菌株的產(chǎn)孢量和菌絲干質(zhì)量見表4。當培養(yǎng)溫度為24 ℃、初始接菌量0.5 mL，培養(yǎng)5 d，產(chǎn)孢量最大，為12.50×105菌落·mL-1。當培養(yǎng)溫度為26 ℃、初始接菌量0.5 mL，培養(yǎng)7 d，產(chǎn)孢量最大，為40.75×105菌落·mL-1；初始接菌量1.0 mL，相同溫度下培養(yǎng)至7 d，產(chǎn)孢量為26.25×105菌落·mL-1?？梢钥闯?，初始接菌量為0.5 mL時，有利于提高孢子產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。

表4 初始接菌量對產(chǎn)孢量和菌絲產(chǎn)量的影響

在培養(yǎng)溫度為24、26 ℃，接菌量1.0 mL時，菌絲干質(zhì)量在培養(yǎng)5 d時達到最大，分別為1.897 5、1.686 3 g。研究還發(fā)現(xiàn)，接菌量為0.05、0.50、1.00、1.50 mL時，培養(yǎng)3、5、7 d，培養(yǎng)溫度24 ℃時的菌絲干質(zhì)量高于培養(yǎng)溫度為26 ℃時。因此，以菌絲生產(chǎn)為目標，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)時，菌絲生物量受培養(yǎng)溫度影響，24 ℃為最適溫度。該試驗的最適溫度與24 ℃溫度條件是利用液體發(fā)酵獲得PC7菌絲的最佳溫度結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

厚垣孢普可尼亞菌在土壤生物防治劑中較為常見，大部分以活性孢子制劑形式投入生產(chǎn)。因此，實現(xiàn)厚垣孢普可尼亞菌孢子的大量生產(chǎn)對防治植物病害具有重要意義。為達到厚垣孢普可尼亞菌孢子發(fā)酵的高產(chǎn)量、低成本、工業(yè)化、大規(guī)模等生產(chǎn)目的，試驗通過在不同溫度、初始pH值、供氧量、接種量等條件對真菌孢子進行液體發(fā)酵，篩選真菌產(chǎn)孢量與菌絲生物量的最適培養(yǎng)條件。研究表明，隨著溫度的升高，PC7產(chǎn)孢數(shù)量隨之增加，PC7孢子可以在20～30 ℃生長，26 ℃是利用液體發(fā)酵獲得PC7孢子的最佳溫度。在以往的報道中，過于酸性或堿性環(huán)境會抑制厚垣孢普可尼亞菌的孢子產(chǎn)量[12]。本試驗中，PC7菌株在pH<6時產(chǎn)孢量較少，當pH=6時產(chǎn)孢量上升，pH=8時的產(chǎn)孢量達到最大值，之后隨pH值升高孢子的產(chǎn)量開始下降。這與厚垣孢普可尼亞PC152菌株[13]在pH值為5、長枝木霉T05菌株[18]在pH值為12時產(chǎn)孢量最大的結(jié)果不同，可能是由于不同菌株形成孢子的特定條件存在差異。

供氧條件是影響PC7菌株液體發(fā)酵產(chǎn)孢的因素之一，裝瓶量不同，供氧狀態(tài)產(chǎn)生差異。PC7菌株培養(yǎng)液在培養(yǎng)溫度為26 ℃、500 mL三角瓶裝瓶量200 mL，培養(yǎng)5 d時，孢子產(chǎn)量達最大值，為最適供氧條件。統(tǒng)一規(guī)格的三角瓶內(nèi)，裝瓶量不同，液體發(fā)酵過程中的通氣量與溶氧量產(chǎn)生變化，僅在最適供氧條件下，可達最大產(chǎn)孢量。不同接菌量條件的PC7菌株的產(chǎn)孢量存在差異。接菌量為0.5 mL，26 ℃下培養(yǎng)7 d，PC7菌株產(chǎn)孢量最大。較高的溫度有利于PC7菌株到達產(chǎn)孢量峰值。溫度升高，PC7菌株的孢子產(chǎn)生速率加快，氧氣消耗量增大。同一培養(yǎng)溫度時，裝瓶量和接菌量過大，產(chǎn)孢量下降，會提升生產(chǎn)成本，造成浪費。故為達到理想的產(chǎn)孢量，需綜合分析溫度、裝瓶量、接菌量等因素對于孢子產(chǎn)量的影響。

以菌絲生產(chǎn)為目標，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)時，溫度、初始pH值、初始裝瓶量、接菌量影響菌絲生物量。較低的培養(yǎng)溫度利于菌絲生物量的累積。溫度24 ℃、初始pH值為8時，有利于提高菌絲產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。初始裝瓶量和接菌量的最適條件為500 mL三角瓶裝瓶量150 mL、初始接菌量1.0 mL，培養(yǎng)5 d時，菌絲干質(zhì)量達到最大。接菌量繼續(xù)加大，菌絲干質(zhì)量逐漸降低。因此，以菌絲生產(chǎn)為目標，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)時，菌絲干質(zhì)量受到培養(yǎng)條件的綜合影響。

厚垣孢普可尼亞菌的液態(tài)發(fā)酵需綜合多個影響因素，除培養(yǎng)溫度、初始pH值、供氧條件、接菌量之外，還受光照、含水量、營養(yǎng)條件、碳氮比、碳氮源、透氣性、水活度等因素的影響[19-21]。雖僅為實驗室的小規(guī)模試驗，但本研究對于指導厚垣孢普可尼亞菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)應用具有一定的意義，為大規(guī)模的厚垣孢普可尼亞菌制劑的液體發(fā)酵生產(chǎn)、應用提供了1個新的方法及途徑。

本研究在不同溫度、初始pH值、供氧量、接種量等條件下對PC7進行液體發(fā)酵，篩選并獲得其產(chǎn)孢量與菌絲生物量的最佳液態(tài)發(fā)酵條件。結(jié)果表明，PC7菌株培養(yǎng)液在培養(yǎng)溫度為26 ℃、初始pH值為8、500 mL三角瓶裝瓶量200 mL時，以0.5 mL為初始接菌量，產(chǎn)孢量在培養(yǎng)5～7 d時達到最大，是最適產(chǎn)孢條件。以菌絲生產(chǎn)為目標，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)時，溫度24 ℃、初始pH值為8、500 mL三角瓶裝瓶量150 mL，初始接菌量1.0 mL時，培養(yǎng)5 d，菌絲干質(zhì)量達到最大，有利于提高菌絲產(chǎn)量，是最適培養(yǎng)條件。