Rg1皂苷單體對(duì)人參銹腐病菌(Ilyonectria robusta)的趨化作用及酶活性的影響1)

陳彥霏 張善銘 許永華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，138118)(人參新品種選育與開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心)

宮赫陽(yáng) 田義新 張連學(xué) 盧寶慧

(龍井市東盛涌鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站)(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))(人參新品種選育與開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心)(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

人參(PanaxginsengC.A.Mey)是五加科植物，人參的干燥根及根莖，主要功效有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智[1]。我國(guó)人參栽培面積居世界首位，吉林省長(zhǎng)白山區(qū)作為我國(guó)人參主產(chǎn)區(qū)，每年人參產(chǎn)量超過(guò)全國(guó)80%[2]。

早年間，中國(guó)栽培人參主要選擇是以毀林種植為主的傳統(tǒng)栽培模式，傳統(tǒng)的伐林栽參模式每年毀林面積高達(dá)2 300 hm2。由此造成了撫松、靖宇、集安、長(zhǎng)白等老參區(qū)開(kāi)始面臨無(wú)林可伐的局面，并且長(zhǎng)期的伐林栽參也帶來(lái)了一系列嚴(yán)重的生態(tài)問(wèn)題[3]。根據(jù)用地的分類，人參栽培方式可以分為伐林栽參、林下護(hù)育栽參、農(nóng)田栽培人參、老參地栽參等。人參的栽培方式主要是依賴人工栽培，傳統(tǒng)栽培模式有人參病害，主要以根部土傳病害為主，也伴有一些地上部病害發(fā)生。大多數(shù)植物根部棲息的細(xì)菌都來(lái)自土壤[4]。種植人參后，土壤pH值降低，出現(xiàn)酸化趨勢(shì)，NH4+和土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低；土壤細(xì)菌多樣性減少，真菌多樣性增加[5-6]。人參在栽培過(guò)程中具有季節(jié)脫落的現(xiàn)象,導(dǎo)致每年有大量的莖葉和部分脫皮的根系在土壤中殘留[7]。Dong et al.[8]對(duì)人參根際微生物群落研究發(fā)現(xiàn)，人參根際微生態(tài)的變化與人參的種植時(shí)間和發(fā)育階段有關(guān)。種植模式[9-10]、生長(zhǎng)年限[11]等都會(huì)影響根際微生物的群落組成，進(jìn)而影響藥材品質(zhì)。人參種植對(duì)土壤養(yǎng)分和理化性質(zhì)產(chǎn)生了直接影響，可能直接產(chǎn)生連作障礙[12]。連作障礙是指在同一土壤連續(xù)種植同一類型植物，植株出現(xiàn)病蟲(chóng)害嚴(yán)重、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降的現(xiàn)象[13]，人參連作后土傳病害發(fā)生嚴(yán)重，其中主要是由于柱孢菌屬(Cylindrocarponspp)引起的人參銹腐病造成的，從人參的苗期到收獲期都有可能發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重的會(huì)使整個(gè)根部生銹腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。人參藥用部位為多年生宿根，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求比較苛刻，很容易受到病原菌侵襲，從而導(dǎo)致病害的發(fā)生，使人參品質(zhì)和產(chǎn)量受到嚴(yán)重制約。

皂苷是植物次生代謝物，同時(shí)也是植物預(yù)先合成的抗菌物質(zhì)，能夠抑制非病原菌的生長(zhǎng)，而植物的病原菌對(duì)總皂苷有較強(qiáng)的化學(xué)趨向性[15-16]。引起人參根部病害主要病原菌是否會(huì)對(duì)皂苷單體有化學(xué)趨向作用及其對(duì)侵染或防御相關(guān)酶活性的影響，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料較少。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)吉林省非林地栽參主要地區(qū)進(jìn)行了銹腐病發(fā)病種類調(diào)查，明確了農(nóng)田栽參過(guò)程中銹腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌粗壯柱孢菌(Ilyonectriarobusta)。通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法以及菌絲干質(zhì)量測(cè)量法初步確定Rg1對(duì)人參銹腐病菌(Ilyonectriarobusta)的趨化作用，通過(guò)測(cè)定施加不同質(zhì)量濃度Rg1后，人參粗壯柱孢菌(I.robusta)侵染和防御相關(guān)酶活力測(cè)定試驗(yàn)確定最佳Rg1添加質(zhì)量濃度。開(kāi)展了Rg1最適質(zhì)量濃度條件下，pH值以及碳氮源對(duì)人參銹腐病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1 試驗(yàn)材料

供試材料：銹腐病患病人參參根采自吉林省人參主產(chǎn)區(qū)，具體見(jiàn)表1。培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

表1 樣品詳細(xì)信息

主要儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH600)，恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-100H)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-ID)、立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，酶標(biāo)儀，霉菌培養(yǎng)箱，凝膠成像設(shè)備(ChemiDoc XRS+)，低溫冷凍離心機(jī)(DH600)。主要試劑藥品：Biofiux真菌DNA提取試劑盒，PCR引物，dNTP，Taq DNA酶，人參皂苷Rg1。

2 研究方法

2.1 人參銹腐菌的分離與純化

供試新鮮的初發(fā)病的人參樣品，用流水沖洗30 min，沖去表面泥沙，用無(wú)菌濾紙吸干表面附水。選取患病部位切成1 cm小段，先用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇進(jìn)行表面消毒3 min，隨后用無(wú)菌水沖洗3～5次，再次用無(wú)菌濾紙吸干表面附水，后將1 cm小段均勻切成3小塊接入PDA培養(yǎng)基中，在(24±1)℃下培養(yǎng)，每隔2 d觀察1次。并將最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布在平板上作為對(duì)照，7 d后無(wú)菌體生長(zhǎng)即為消毒成功。

獲得的人參銹腐菌采用單飽子分離純化法進(jìn)行純化分離，得到銹腐菌株在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

致病性測(cè)定：通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證分離出的人參銹腐菌的致病力。

2.2 人參銹腐菌鑒定

病菌形態(tài)學(xué)觀察：將8 mm菌餅置于PDA平板上，24 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后觀察病原菌的培養(yǎng)性狀，包括菌落顏色及氣生菌絲情況。顯微鏡檢測(cè)觀察病菌子實(shí)體形態(tài)并拍照。

分子生物學(xué)鑒定：采用試劑盒提取法提取菌絲DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。選擇真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS)擴(kuò)增的通用引物ITS5(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，MgCl2(2.5 mmol/L)1 μL，1 μL ITS4，1 μL ITS5，1 μL模板DNA，0.5 μL rTaq(5 U/μL)。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，總共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量合格后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Gen Bank(http：//www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并用MEGA6.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3 Rg1最佳趨化質(zhì)量濃度測(cè)定

本研究擬采用從生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法、菌絲干質(zhì)量測(cè)量法3種方法相結(jié)合，確定最適Rg1皂苷單體質(zhì)量濃度。

生長(zhǎng)速率法?；A(chǔ)培養(yǎng)基為馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 mL不同設(shè)定質(zhì)量濃度的皂苷單體，對(duì)照組加入1 mL與試驗(yàn)組中皂苷單體相同的溶劑。如圖1中所示：最小圓環(huán)為直徑8 mm的人參銹腐病菌菌餅；(A1+A2)為對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，采用“十字交叉法”測(cè)量，取其平均值；(B1+B2)為加入不同質(zhì)量濃度皂苷組菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，采用“十字交叉法”測(cè)量，取其平均值。當(dāng)皂苷單體對(duì)人參銹腐病菌生長(zhǎng)為抑制作用時(shí)，(A1+A2)>(B1+B2)，菌絲生長(zhǎng)抑制率={[(A1+A2)-(B1+B2)]/(A1+A2)}×100%；當(dāng)皂苷單體對(duì)人參病原真菌生長(zhǎng)為促進(jìn)作用時(shí)，(A1+A2)<(B1+B2)，菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)率={[(B1+B2)-(A1+A2)]/(A1+A2)}×100%。

圖1 生長(zhǎng)速率法圖示

孢子萌發(fā)法?；A(chǔ)培養(yǎng)基為1%葡萄糖溶液，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的皂苷單體即為試驗(yàn)組。產(chǎn)孢人參銹腐病菌培養(yǎng)完成后，無(wú)菌水沖洗孢子及菌絲，采用Miracloth神奇濾布過(guò)濾掉菌絲，剩余即為孢子懸浮液。將孢子懸浮液稀釋至所需濃度，不同試驗(yàn)處理加入相應(yīng)質(zhì)量的皂苷單體，觀察1、2、4、6 h時(shí)間段皂苷單體對(duì)孢子萌發(fā)的影響。

菌絲干質(zhì)量測(cè)量?；A(chǔ)培養(yǎng)基為馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(PD)，取相同質(zhì)量菌絲加入到裝有150 mL的滅菌馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，試驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度的皂苷單體，置于恒溫振蕩搖床中振蕩培養(yǎng)，160 r/min，培養(yǎng)5 d；采用中速定性濾紙過(guò)濾菌絲，置于烘箱中35 ℃烘干，稱其干質(zhì)量。比較皂苷單體不同處理對(duì)人參銹腐病菌菌絲干質(zhì)量的影響。

2.4 Rg1不同質(zhì)量濃度下對(duì)人參粗壯柱孢菌(Ilyonectria robusta)侵染相關(guān)酶活力的影響

室內(nèi)條件：采用相應(yīng)試劑盒(北京安迪華泰科技有限公司和北京誠(chéng)林生物科技有限公司)測(cè)定Rg1不同質(zhì)量濃度誘導(dǎo)條件下人參粗壯柱孢菌(Ilyonectriarobusta)生長(zhǎng)相關(guān)酶，過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)活性。

粗酶液制備：1.液體擴(kuò)大培養(yǎng)。取孢子懸浮液1 mL，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(50 mL錐型瓶中裝培養(yǎng)基27 mL+3 mL皂苷),25 ℃下160 r/min搖床培養(yǎng)4 d，制得菌體培養(yǎng)液。2.銹腐病菌菌體細(xì)胞的制備。將擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液置于2 mL離心管,12 000 r/min離心5 min，除去上清液,得菌體細(xì)胞,待用。3.細(xì)胞破壁。取上一步驟粗提取的銹腐病菌菌體細(xì)胞于研缽中,加入液氮,充分研磨均勻。4.粗酶液的提取。將破壁后的銹腐病菌菌體細(xì)胞懸浮液1 mL，置于高速冷凍離心機(jī)中，12 000 r/min離心2 min，上清液即為粗酶液。

2.5 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

根據(jù)2.3測(cè)得Rg1最佳趨化質(zhì)量濃度，在此條件下用HCl(1 mol/L)和NaOH(1 mol/L)無(wú)菌水溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。用打孔器取剛長(zhǎng)滿平板的銹腐病菌菌餅接種到調(diào)好pH值的PDA平板中央，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次，9 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并測(cè)量菌絲干質(zhì)量。

2.6 不同碳氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

根據(jù)2.3測(cè)得Rg1最佳趨化質(zhì)量濃度，在此條件下采用察氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別以甘露醇、蔗糖、果糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖和乳糖作為碳源，分別以尿素、硫酸銨、硝酸鉀、牛肉膏、硝酸銨、硝酸鈉為氮源。將銹腐病菌菌餅分別接種于不同碳、氮源處理的培養(yǎng)基平板中央，以不加碳氮、源的察氏培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，25 ℃培養(yǎng)9 d，后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

3 結(jié)果與分析

3.1 柯赫氏法則結(jié)果

本試驗(yàn)(圖2)共鑒定出74株菌，并完成柯赫氏法則驗(yàn)證，均為人參銹腐病菌。

圖2 銹腐病菌侵染人參

3.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

本試驗(yàn)共鑒定出74株菌，并完成柯赫氏法則驗(yàn)證，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定均為人參銹腐病菌。測(cè)定結(jié)果表明(圖3)，菌株氣生菌絲生長(zhǎng)茂盛，初灰白色，后至棕褐色，菌絲生長(zhǎng)較慢，氣生菌絲為絮狀，并能以擴(kuò)散或分生孢子座的方式產(chǎn)生孢子。培養(yǎng)9 d后菌落直徑7.6 cm,菌絲寬2.3 cm，分生孢子無(wú)色，多為大型分生孢子，圓柱形或兩端鈍圓，孢子直或彎曲，有一個(gè)或多個(gè)橫隔膜。有一些能產(chǎn)生單胞無(wú)隔膜小型分生孢子，生長(zhǎng)發(fā)育后期能夠產(chǎn)生厚垣孢子，厚垣孢子一般夾生或端生。

圖3 人參銹腐菌分離及孢子形態(tài)觀察

3.3 分子鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

選取其中4株代表性菌株，分別為XF001、XF002、XF003、XF004進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。同時(shí)試驗(yàn)選用XF001進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)?；贗TS rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，XF001菌株與登錄號(hào)為MN091950.1的親緣關(guān)系最近，處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一分枝。因此，確定XF001為人參粗壯柱孢菌(Ilyonectriarobusta)。

3.4 具有明顯趨化作用的Rg1皂苷單體質(zhì)量濃度

生長(zhǎng)速率法。PDA培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度Rg1皂苷單體，對(duì)人參銹腐病菌生長(zhǎng)均有不同程度地促進(jìn)作用，9 d后促進(jìn)效果呈顯著性差異。

當(dāng)PDA培養(yǎng)基中加入的Rg1皂苷質(zhì)量濃度為2 mg/L，25 ℃培養(yǎng)9 d時(shí)的菌絲顏色最深，為深棕褐色(圖5)。菌落直徑為(76.950 0±0.132 3)mm，菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)率為10.710%。當(dāng)皂苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)菌絲生長(zhǎng)最慢，菌落直徑為(69.583 3±4.125 6)mm，菌絲生長(zhǎng)抑制率為3.844%。

圖4 基于ITS的rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

圖5 生長(zhǎng)速率照片

孢子萌發(fā)法。測(cè)定結(jié)果表明(表2)，在6 h后人參皂苷Rg1對(duì)粗壯柱孢菌孢子的萌發(fā)呈顯著性的促進(jìn)作用。當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)對(duì)柱孢菌孢子萌發(fā)促進(jìn)效果最顯著，SGR為(20.666 7±1.527 5)%。當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)SGR為(14.666 7±0.577 4)%。與對(duì)照組相比對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用。

表2 不同質(zhì)量濃度Rg1在1、2、4、6 h時(shí)柱孢菌孢子萌發(fā)率

菌絲干質(zhì)量測(cè)量。菌絲干質(zhì)量測(cè)定結(jié)果表明(表3)，人參皂苷Rg1對(duì)粗壯柱孢菌孢子的菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)對(duì)粗壯柱孢菌菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好，菌絲干質(zhì)量為(2.363 3±0.092 9)g。對(duì)照組菌絲干質(zhì)量為(1.990 0±0.085 4)g；當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)菌絲干質(zhì)量為(1.963 3±0.066 6)g；當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)菌絲干質(zhì)量為(2.016 7±0.037 9)g；當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)菌絲干質(zhì)量為(2.116 7±0.025 2)g；當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)菌絲干質(zhì)量為(2.216 7±0.025 2)g。

表3 不同質(zhì)量濃度Rg1對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

3.5 Rg1最適質(zhì)量濃度對(duì)人參粗壯柱孢菌侵染相關(guān)酶活力

過(guò)氧化物酶(POD)：試劑盒測(cè)定結(jié)果表明(表4)，第5 d后當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L誘導(dǎo)條件下人參粗壯柱孢菌酶活性最強(qiáng)，且呈顯著性差異。POD酶活性最高為(157.231 0±5.167 5)ng/L。當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為1 mg/L誘導(dǎo)條件下人參粗壯柱孢菌POD酶活性最低為(95.692 5±18.765 9)ng/L。

表4 侵染相關(guān)酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

過(guò)氧化氫酶(CAT)：試劑盒測(cè)定結(jié)果表明(表5)，第5 d后當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L誘導(dǎo)條件下人參粗壯柱孢菌CAT酶活性最強(qiáng)，且呈顯著性差異。CAT酶活性最高為(4.481 0±0.321 0)U/mL。對(duì)照組誘導(dǎo)條件下人參粗壯柱孢菌CAT酶活性最低為(1.607 5±0.962 4)U/mL。

表5 Rg1不同質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)人參粗壯柱孢菌POD、CAT、PPO、酶活性的影響

多酚氧化酶(PPO)：試劑盒測(cè)定結(jié)果表明(表8)，第5 d后當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L誘導(dǎo)條件下人參粗壯柱孢菌PPO酶活性最強(qiáng)，且呈顯著性差異。PPO酶活性最高為(3.472 5±0.020 5)IU/L。當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為0.5 mg/L誘導(dǎo)條件下人參粗壯柱孢菌PPO酶活性最低為(1.585 0±0.114 6)IU/L。

3.6 Rg1最適質(zhì)量濃度時(shí)不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)9 d后，如圖6和表6所示。人參粗壯柱孢菌在pH值4.0～8.0均可生長(zhǎng)，其中pH值為5.0時(shí)病原菌生長(zhǎng)最好，其菌落直徑達(dá)(74.333 3±0.152 8)mm；菌絲干質(zhì)量為(91.600 0±1.452 6)mg；在pH值為4.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最慢，菌落直徑為(58.600 0±0.458 3)mm；菌絲干質(zhì)量為(45.766 7±0.305 5)mg；顯著小于其他pH值條件下菌落直徑(P<0.05)。pH值為6.0時(shí)菌落直徑達(dá)(73.100 0±0.360 6)mm；菌絲干質(zhì)量為(76.833 3±0.305 5)mg；pH值為7.0時(shí)菌落直徑達(dá)(71.900 0±0.608 3)mm；菌絲干質(zhì)量為(69.966 7±0.416 3)mg；pH值為8.0時(shí)菌落直徑達(dá)(67.300 0±0.264 6)mm；菌絲干質(zhì)量為(62.333 3±0.251 7)mg。

圖6 不同pH值柱孢菌生長(zhǎng)速率(9 d)

表6 不同pH值對(duì)菌絲干質(zhì)量影響

3.7 Rg1最適質(zhì)量濃度時(shí)不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

研究表明，菌絲在不同碳源條件下培養(yǎng)至第9 d時(shí)，菌落生長(zhǎng)均趨于緩慢。從表7可知，不同碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)影響呈顯著性差異(P<0.05)。與對(duì)照相比，甘露醇、蔗糖、麥芽糖和葡萄糖，均適宜病原菌生長(zhǎng)；其中葡萄糖作為碳源菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑為(70.666 7±2.362 9)mm，平均生長(zhǎng)速率為6.963 mm/d，且菌絲致密，菌落較厚，邊緣光滑；以甘露醇和蔗糖為碳源次之，菌落直徑分別為(69.500 0±0.500 0)mm，平均生長(zhǎng)速率為6.833 mm/d，(69.666 7±1.527 5)mm，平均生長(zhǎng)速率為6.852 mm/d，菌落灰白色，菌絲致密；生長(zhǎng)最差的碳源是乳糖，菌落直徑(62.500 0±2.500 0)mm，平均生長(zhǎng)速率為6.056 mm/d，菌絲呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，邊緣平滑整齊?？傮w趨勢(shì)由大到小為葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、CK、果糖、木糖、乳糖。

表7 病原菌在不同碳源上菌落直徑和生長(zhǎng)速率

3.8 Rg1最適質(zhì)量濃度時(shí)不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

研究表明，菌絲在不同氮源條件下培養(yǎng)至第9 d時(shí)，菌落生長(zhǎng)均趨于緩慢(表8)。從表11可知，不同氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響呈顯著性差異(P<0.05)。

表8 不同氮源條件下病原菌菌落直徑和生長(zhǎng)速率

在氮源利用方面，硝酸鉀作為氮源病原菌菌絲生長(zhǎng)最好，菌落直徑為(70.500 0±0.500 0)mm，平均生長(zhǎng)速率為6.944 mm/d，菌落較厚，邊緣光滑;其次是硝酸銨作為氮源，菌落直徑為(67.166 7±1.527 5)mm，平均生長(zhǎng)速率為6.574 mm/d，菌落略薄，邊緣光滑;硫酸銨為氮源，生長(zhǎng)最差，菌落直徑(55.000 0±8.261 4)mm，平均生長(zhǎng)速率為5.222 mm/d，菌落較厚，菌絲為白色絲絨狀，邊緣不規(guī)則。

4 結(jié)論與討論

由柱孢菌屬(Cylindrocarponspp)引起的人參銹腐病，因其可在土壤中可存活多年，且病原菌可逐年累積，是人參連作障礙中發(fā)生最普遍和最嚴(yán)重的土傳病害。粗壯柱孢菌作為引起人參銹腐病分離頻率最高，致病能力最強(qiáng)的病原菌，在人參銹腐病的研究中顯得尤為重要。人參連作障礙，一直以來(lái)是人參栽培上的一大難題，不僅降低人參的產(chǎn)量和品質(zhì)，帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)嚴(yán)重制約著人參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。人參皂苷是人參生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一類主要次生代謝產(chǎn)物，在植物體與微生物之間起著一定調(diào)節(jié)作用，而且由于皂苷在土壤中的累積，尤其是Rg1的質(zhì)量濃度對(duì)人參銹腐病菌的趨化作用以及對(duì)人參本身的自毒作用，與人參連作障礙是否有關(guān)，關(guān)系有多大，是必須要解決的科學(xué)問(wèn)題。

匙坤等[15]研究人參銹腐菌分別對(duì)低、中質(zhì)量濃度的人參總皂苷表現(xiàn)出較強(qiáng)的化學(xué)趨向性響應(yīng)，而且在最優(yōu)趨化參數(shù)下人參銹腐菌的SGR、CGR以及MG等都得到了顯著提高，但卻隨人參總皂苷質(zhì)量濃度的升高而降低，尤其在進(jìn)行高濃度培養(yǎng)時(shí)，人參銹腐菌仍然保持著正的化學(xué)趨向性響應(yīng)。采用趨化性實(shí)驗(yàn)，確定人參銹腐菌分別對(duì)不同質(zhì)量濃度的人參總皂苷表現(xiàn)出不同程度的化學(xué)趨向性響應(yīng)。

CAT能夠促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害[17]。多酚氧化酶(PPO)是一類核基因編碼酶，受多個(gè)基因控制，主要存在質(zhì)體類囊體腔中，在植物中主要指兒茶酚氧化酶。PPO對(duì)植物抵御外界脅迫、光合作用、生物合成等起重要作用，但在果蔬中PPO常引起負(fù)面效應(yīng)，使顏色、味道、營(yíng)養(yǎng)等受到破壞，嚴(yán)重影響制品的外觀品質(zhì)。

本研究通過(guò)生長(zhǎng)速率法、菌絲干重法、孢子萌發(fā)法相結(jié)合研究Rg1對(duì)人參粗壯柱孢菌的影響，初步確定當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)對(duì)引起人參銹腐病的粗壯柱孢菌(Ilyonectriarobusta)有顯著促進(jìn)作用。通過(guò)對(duì)人參粗壯柱孢菌侵染相關(guān)酶活力測(cè)定進(jìn)一步確定當(dāng)Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)對(duì)人參粗壯柱孢菌有顯著促進(jìn)作用。在Rg1皂苷最適誘導(dǎo)條件下CAT、PPO、POD能增強(qiáng)人參銹腐菌侵染人參的能力。

張鴻雁等[18]研究當(dāng)pH值為6～7時(shí)生長(zhǎng)速度達(dá)到高峰，pH值再增加，生長(zhǎng)逐漸減弱，毀滅柱孢菌最適合生長(zhǎng)pH值為6.2左右，中性偏酸環(huán)境。本研究結(jié)果表明在Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)最適粗壯柱孢菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基pH值是5.0。最適粗壯柱孢菌生長(zhǎng)的碳源是葡萄糖，氮源是硝酸鉀。

綜上，當(dāng)人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)對(duì)人參粗壯柱孢菌的生長(zhǎng)發(fā)育具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，在此條件下粗壯柱孢菌的侵染相關(guān)酶的活力最高。研究結(jié)果為揭示人參忌地性以及連作障礙產(chǎn)生的原因提供參考依據(jù)，也為生產(chǎn)上更加有針對(duì)性的防治該病害奠定基礎(chǔ)。