重組Tet-on COLIA1基因腺病毒骨組織靶向表達(dá)對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松骨折愈合生物力學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究

吳元?jiǎng)?，曾羿，李明?yáng)，劉淵，裴福興，沈彬

骨質(zhì)疏松是一種以骨量下降、骨顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征的退行性疾病，嚴(yán)重危害中老年人群的生命健康[1-3]。研究證實(shí)，骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展與Ⅰ型膠原結(jié)構(gòu)和含量的病理改變密切相關(guān)[4,5]。Ⅰ型膠原主要由2 條α1 鏈（由COLIA1基因編碼）和1 條α2 鏈（由COLIA2基因編碼）形成三螺旋纖維狀結(jié)構(gòu)，廣泛存在于骨骼組織中[6,7]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Tet-on 轉(zhuǎn)染后的COLIA1基因在骨組織中具有靶向表達(dá)能力，能夠增加成骨細(xì)胞COLIA1mRNA 表達(dá)量及Ⅰ型膠原含量，促進(jìn)成骨形成[8]。因此，本研究在構(gòu)建大鼠骨質(zhì)疏松骨折動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步研究重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松骨折愈合生物力學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及藥物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)（丹麥Heto-Hoten 公司），1.0 mm 克氏針（上海醫(yī)療器械有限公司），游標(biāo)卡尺（北京儀器廠生產(chǎn)），外科手術(shù)器械[上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司]，雙能X 線骨密度測(cè)量?jī)x（美國(guó)DMS 公司），電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)-5967（美國(guó)Instron 公司），Micro-CT（瑞士Scanco Medical公司）等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

10%水合氯醛（四川大學(xué)華西醫(yī)院科技園），重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒（上海吉?jiǎng)P公司），鹽酸強(qiáng)力霉素（美國(guó)Sigma公司）等。

1.2 大鼠骨質(zhì)疏松骨折動(dòng)物模型的建立

健康雌性SD大鼠（清潔級(jí)）40只，體重241～282 g，平均（264±10）g，購(gòu)自四川達(dá)碩生物有限公司，飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西校區(qū)基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

40只健康雌性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為手術(shù)組和假手術(shù)組，其中手術(shù)組36只，假手術(shù)組4只。手術(shù)組大鼠切除雙側(cè)卵巢，建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。假手術(shù)組大鼠僅切開(kāi)皮膚，不切除雙側(cè)卵巢。

手術(shù)組36 只大鼠切除雙側(cè)卵巢3 個(gè)月后，隨機(jī)選取4只并處死，同時(shí)處死假手術(shù)組4只大鼠。收集其脛骨標(biāo)本，采用雙能X線測(cè)量假手術(shù)組和手術(shù)組大鼠骨密度，以證實(shí)大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。

隨后，將其余32 只骨質(zhì)疏松大鼠用薄電鋸片從脛骨中段橫行切斷骨干，保證骨折斷端光滑整齊，然后使用1.0 mm 克氏針固定脛骨骨折斷端，以構(gòu)建大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將32 只骨質(zhì)疏松骨折大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組各8只。

實(shí)驗(yàn)分組如下：A 組，重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒+強(qiáng)力霉素組；B組，重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒組；C組，強(qiáng)力霉素+Tet-on空白腺病毒組；D組，空白對(duì)照組。

骨質(zhì)疏松骨折大鼠用藥方法如下：A組，使用強(qiáng)力霉素（100 mg/kg）以灌胃的方式喂養(yǎng)骨質(zhì)疏松骨折大鼠1 周，隨后在脛骨骨折斷端局部注射重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒，劑量為1.5×108ifu/kg；B 組，采用實(shí)驗(yàn)室的普通飼料喂養(yǎng)骨質(zhì)疏松骨折大鼠1 周，隨后在脛骨骨折斷端局部注射重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒，劑量為1.5×108ifu/kg；C 組，使用強(qiáng)力霉素（100 mg/kg）以灌胃的方式飼喂骨質(zhì)疏松骨折大鼠1 周；隨后在脛骨骨折斷端局部注射空白Tet-on腺病毒，劑量為1.5×108ifu/kg；D 組，采用實(shí)驗(yàn)室的普通飼料喂養(yǎng)骨質(zhì)疏松骨折大鼠1 周，隨后在脛骨骨折斷端局部注射生理鹽水。

1.4 取材及檢測(cè)方法

分別于注射腺病毒6、8 周后每組各處死大鼠4 只，收集脛骨標(biāo)本后行micro-CT 掃描和生物力學(xué)試驗(yàn)。

術(shù)者仔細(xì)剔除標(biāo)本表面的肌肉、筋膜等軟組織成分，小心地取下克氏針，在對(duì)標(biāo)本編號(hào)后，采用生理鹽水浸透的紗布包裹后行micro-CT 掃描，以觀察骨痂形態(tài)、連續(xù)性、皮質(zhì)厚度等。

在電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量脛骨標(biāo)本中段外徑。將標(biāo)本放在有一定距離的兩個(gè)支撐點(diǎn)上，在兩個(gè)支撐點(diǎn)中點(diǎn)上方向標(biāo)本施加向下的載荷，標(biāo)本的三個(gè)接觸點(diǎn)形成相等的兩個(gè)力矩時(shí)即發(fā)生三點(diǎn)彎曲。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)定加載速率為2 mm/min，支點(diǎn)跨距為20 mm，用函數(shù)記錄儀描記載荷-變形曲線。根據(jù)載荷-變形曲線和皮質(zhì)骨內(nèi)外徑分析骨的生物力學(xué)性能參數(shù)。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的力學(xué)指標(biāo)包括：最大載荷、彈性模量、屈服點(diǎn)最大應(yīng)力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均符合正態(tài)分布，以表示。采用t檢驗(yàn)比較假手術(shù)組和手術(shù)組大鼠骨密度的差異；采用方差分析比較A、B、C、D 四組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)生物力學(xué)指標(biāo)的差異，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型建立

術(shù)后3個(gè)月，手術(shù)組大鼠脛骨骨密度低于假手術(shù)組大鼠[（0.262±0.048）g/cm2vs（0.381±0.024）g/cm2]，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），表明大鼠骨質(zhì)疏松模型制備成功。

2.2 最大載荷

腺病毒轉(zhuǎn)染6、8周后，A組大鼠脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)最大載荷均高于B、C、D 三組大鼠，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D 三組大鼠的最大載荷兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒后脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)最大載荷比較（n=4，，N）

表1 4組大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒后脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)最大載荷比較（n=4，，N）

注：△P＜0.05，與A組比較

2.3 彈性模量（自動(dòng)楊氏）

腺病毒轉(zhuǎn)染6、8周后，A組大鼠脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)彈性模量均高于B、C、D 三組大鼠，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D 三組大鼠的彈性模量?jī)蓛杀容^差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒后脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)彈性模量（自動(dòng)楊氏）比較（n=4，，MPa）

表2 4組大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒后脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)彈性模量（自動(dòng)楊氏）比較（n=4，，MPa）

注：△P＜0.05，與A組比較

2.4 屈服點(diǎn)最大應(yīng)力

腺病毒轉(zhuǎn)染6、8周后，A組大鼠脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)屈服點(diǎn)最大應(yīng)力均高于B、C、D 三組大鼠，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C、D三組大鼠的屈服點(diǎn)最大應(yīng)力兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒后脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)屈服點(diǎn)最大應(yīng)力比較（n=4，，N）

表3 4組大鼠轉(zhuǎn)染腺病毒后脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)屈服點(diǎn)最大應(yīng)力比較（n=4，，N）

注：△P＜0.05，與A組比較

2.5 骨折斷端Micro-CT檢測(cè)

在腺病毒轉(zhuǎn)染6周后，A組大鼠骨折斷端更加模糊，骨痂形成好。轉(zhuǎn)染8周后，A、B、C、D四組大鼠骨痂骨折線基本消失，其中A組大鼠骨皮質(zhì)光滑、較厚、較連續(xù)；B、C、D三組大鼠骨痂略欠光滑，局部殘留大小不等的腔隙（圖1）。

圖1 腺病毒轉(zhuǎn)染6周、8周后四組大鼠骨折斷端micro-CT檢測(cè)結(jié)果

3 討論

骨有機(jī)質(zhì)中含有大量的膠原纖維，其中以Ⅰ型膠原纖維為主，約占90%[9,10]。研究表明，Ⅰ型膠原數(shù)量、質(zhì)量的減少會(huì)造成骨細(xì)胞中有機(jī)質(zhì)含量的下降，最終導(dǎo)致鈣鹽沉積不足和鈣結(jié)節(jié)數(shù)量下降[11,12]。對(duì)絕經(jīng)后婦女的研究進(jìn)一步證實(shí)，雌激素分泌減少也會(huì)造成成骨細(xì)胞和Ⅰ型膠原纖維形成因子合成減少，導(dǎo)致骨有機(jī)質(zhì)含量降低，骨脆性增加，易發(fā)生骨折[13-15]。因此，作為骨骼支架、礦化核心和形成骨力學(xué)強(qiáng)度最基本的有機(jī)質(zhì)蛋白，Ⅰ型膠原纖維減少，即使鈣鹽沉積充足，仍會(huì)造成骨強(qiáng)度降低，誘發(fā)骨折[16-18]。

本課題組在前期對(duì)髖、膝關(guān)節(jié)置換患者松質(zhì)骨培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞的基因型鑒定研究中，成功篩選出COLIA1基因-1997G/T 位點(diǎn)多態(tài)性存在3 種基因型——GG型（野生純合子型）、GT型（雜合突變型）、TT型（純合突變型）的成骨細(xì)胞株，測(cè)定出GG型、GT型成骨細(xì)胞的COLIA1mRNA表達(dá)量、Ⅰ型膠原含量、鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及細(xì)胞基質(zhì)鈣含量均高于TT型成骨細(xì)胞。隨后構(gòu)建過(guò)表達(dá)COLIA1基因的腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染到TT型成骨細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)COLIA1基因的腺病毒轉(zhuǎn)染后的TT型成骨細(xì)胞主要表現(xiàn)為Ⅰ型膠原α1鏈mRNA的表達(dá)水平、Ⅰ型膠原的含量、細(xì)胞基質(zhì)鈣含量等較未感染組有顯著提高[19,20]。但是，腺病毒的過(guò)表達(dá)也可能會(huì)給身體其他部位帶來(lái)危害。近年來(lái)研究表明，Tet-on系統(tǒng)不但能夠控制基因表達(dá)，同時(shí)利用四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素對(duì)骨組織具有較高的親和性的特點(diǎn)，在基因調(diào)控系統(tǒng)中起到“開(kāi)關(guān)”作用[21-24]。

生物力學(xué)性能增強(qiáng)能從側(cè)面反映腺病毒基因治療骨質(zhì)疏松，提高Ⅰ型膠原含量，增強(qiáng)骨礦化和密度，使骨的抗壓縮抗折彎能力增強(qiáng)。國(guó)外的諸多學(xué)者也證實(shí)了Ⅰ型膠原纖維與生物力學(xué)有密切關(guān)系，主要表現(xiàn)為其抗機(jī)械性的變化。Connizzo 等[25]通過(guò)對(duì)2型糖尿病小鼠模型肌腱的研究發(fā)現(xiàn)，因2型糖尿病引起Ⅰ型膠原結(jié)構(gòu)改變，如不規(guī)則的纖維形態(tài)及密度等，與非糖尿病組小鼠對(duì)比，其橫截面積、剛度和彈性模量均降低，說(shuō)明在改變Ⅰ型膠原的含量和結(jié)構(gòu)后，肌腱的機(jī)械性能和載荷發(fā)生明顯的下降。Fazaeli 等[26]的研究也得到了膠原纖維能影響骨組織的生物力學(xué)的相似結(jié)論，他們通過(guò)研究豬顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)中膠原纖維在顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)機(jī)械壓縮性能中的結(jié)構(gòu)功能作用發(fā)現(xiàn)，通過(guò)消化酶分解關(guān)節(jié)盤(pán)中的膠原纖維后，關(guān)節(jié)盤(pán)的瞬時(shí)抗壓模量減少多達(dá)50%～90%。此外，進(jìn)一步對(duì)標(biāo)本進(jìn)行生化分析，膠原蛋白和黏多糖含量的下降平均分別達(dá)到14%和35%。研究者得出結(jié)論：即使輕度破壞膠原纖維，也可以導(dǎo)致大量的機(jī)械軟化顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)破壞和機(jī)械穩(wěn)定性下降。

本研究采用脛骨的三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A組大鼠的生物力學(xué)指標(biāo)要明顯優(yōu)于B、C、D 三組大鼠。其中，A組大鼠的最大負(fù)荷、彈性模量、屈服點(diǎn)最大應(yīng)力在腺病毒轉(zhuǎn)染6、8周后，高于B、C、D三組大鼠，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，micro-CT顯示A組大鼠骨痂愈合的情況均優(yōu)于其余三組大鼠，說(shuō)明通過(guò)Tet-on調(diào)控的COLIA1基因可以有效促進(jìn)大鼠骨質(zhì)疏松骨折的骨痂形成、縮短骨折愈合的時(shí)間。因此，本研究證實(shí)，重組Ten-onCOLIA1基因腺病毒在骨組織靶向表達(dá)不僅能有效地增加骨折斷端愈合能力、縮短骨折愈合的時(shí)間，還能有效地提高骨折愈合后的生物力學(xué)性能，達(dá)到最終治療骨質(zhì)疏松，提高骨強(qiáng)度的目的。

本研究仍存在一定的不足：①骨組織標(biāo)本的制作及其實(shí)際操作對(duì)生物力學(xué)特性測(cè)定的結(jié)果有重要的影響，也是實(shí)驗(yàn)成敗與否的重要步驟。因此，在標(biāo)本的制作過(guò)程中，考慮到操作者的主觀因素，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成偏差；②有研究認(rèn)為骨質(zhì)疏松骨折愈合時(shí)間長(zhǎng)，骨痂生長(zhǎng)較慢，再到骨折塑形可能長(zhǎng)達(dá)12周以上，本研究轉(zhuǎn)染后僅觀察了8周，因此，觀察的時(shí)間可能較短。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了大鼠骨質(zhì)疏松骨折動(dòng)物模型，將重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒成功轉(zhuǎn)染至脛骨骨折斷端。在轉(zhuǎn)染6、8周后，通過(guò)脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)重組Tet-onCOLIA1基因腺病毒轉(zhuǎn)染的大鼠，在強(qiáng)力霉素的作用下，能有效改善其生物力學(xué)性能，提高骨強(qiáng)度，最終促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折愈合。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突