小麥赤霉病禾谷鐮孢菌生物基增效劑的篩選

張 盈，黃文源，魏 進(jìn)，龍家寰，高 迪，段婷婷

(貴州省植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

0 引言

【研究意義】普通小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的糧食作物之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，養(yǎng)育了世界上約1/3的人口[1]。小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)由禾谷鐮刀菌、亞洲鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、梨孢鐮刀菌、黃色鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和串珠鐮刀菌等引起，病菌侵染后主要引起莖基腐、苗枯、稈腐和穗腐[2-3]，是危害小麥最嚴(yán)重的病害之一，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)上造成的產(chǎn)量損失一般為17.17%，輕發(fā)年份造成的損失為10萬(wàn)t，重發(fā)流行年份造成的損失達(dá)200余萬(wàn)t，大流行年份可導(dǎo)致部分田塊絕收[4-5]。目前，小麥赤霉病主要依賴于化學(xué)藥劑防治，而藥劑品種相對(duì)較為單一，且隨著其長(zhǎng)期使用，靶標(biāo)菌產(chǎn)生了極嚴(yán)重的抗藥性。因此，研究開(kāi)發(fā)新藥劑品種應(yīng)用于生產(chǎn)防治具有重要意義[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】戊唑醇(Tebuconazole)屬三唑類(lèi)，是C-14-脫甲基酶抑制劑，抑制真菌細(xì)胞膜麥角甾醇的生物合成，對(duì)小麥赤霉病有較高的防效[7-8]。丙硫唑(Albendazole)和多菌靈(Carbendazim)均屬苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，作用于赤霉病病菌的β-微管蛋白，抑制細(xì)胞的有絲分裂[9]。多菌靈對(duì)小麥赤霉病防效較高，是最早防治赤霉病的傳統(tǒng)藥劑，農(nóng)戶認(rèn)可度高且成本低；丙硫唑又稱丙硫多菌靈，2016年開(kāi)始登記用于防控赤霉病[10]，效果較好，且由于使用時(shí)間較短，較少產(chǎn)生抗性問(wèn)題?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，赤霉病抗性廣泛發(fā)生，如在江蘇、安徽和河南等地檢測(cè)到對(duì)多菌靈的抗性頻率為58.8%、37.7%和4.8%，在江蘇和安徽的抗藥程度達(dá)危險(xiǎn)水平；在山西、江蘇、安徽、山東、河南、湖北和陜西等7個(gè)省均檢測(cè)到抗戊唑醇的抗性菌株，抗性頻率1.2%～6.1%[11]。抗性的產(chǎn)生和增大必然引起農(nóng)藥的超標(biāo)使用甚至濫用，加快抗性增長(zhǎng)，造成農(nóng)業(yè)環(huán)境污染的同時(shí)也帶來(lái)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。新農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)難度大、時(shí)間長(zhǎng)，農(nóng)藥輪換使用和農(nóng)藥復(fù)配則成為目前病害抗性治理的常規(guī)手段。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選擇小麥赤霉病防控效果較好的戊唑醇、丙硫唑和多菌靈3種化學(xué)農(nóng)藥與苦參、黃岑片和丹參等9種中藥提取物進(jìn)行復(fù)配，探明其對(duì)小麥赤霉病的防控效果并篩選出中藥提取物抑菌活性較好的生物基增效劑，以期為小麥赤霉病防控上抑菌活性較好的生物基增效劑的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 小麥赤霉病禾谷鐮孢菌(FusariumgraminarumSchw)，由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)安實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥劑 98%多菌靈原藥、95%戊唑醇原藥和98%丙硫唑原藥，均由貴州道元生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[8]的方法組配配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL；煮好后在121℃條件下滅菌20 min，冷卻至50℃左右備用。

1.1.4 中藥材 苦參、黃岑片、丹參、川銀花、干魚(yú)腥、馬齒莧、黃連片、五倍子和野菊花共計(jì)9種，市購(gòu)。

1.1.5 儀器設(shè)備 HIRAYAMA-50滅菌器(日本Hirayama)、SJ-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn))、BIC-400人工氣候箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn))、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))、10 mL離心管、移液槍、10 mL量杯、9 mm培養(yǎng)皿等。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制備 將中藥研磨成粉，用無(wú)水乙醇浸泡7 d后過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，直到?jīng)]有乙醇蒸出；取出，4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 9種中藥提取物對(duì)小麥赤霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果 在滅菌培養(yǎng)皿中倒入9 mL PDA培養(yǎng)基和1 mL藥劑稀釋液，充分搖勻，制成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基平板。用打孔器取已活化的病菌菌餅，菌絲面朝下接種于含藥培養(yǎng)基平板中央，以不含藥培養(yǎng)基平板接菌為對(duì)照，3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待對(duì)照培養(yǎng)基上菌落直徑約為培養(yǎng)皿直徑的80%時(shí)，測(cè)量不同處理的菌落直徑，計(jì)算抑制率。

1.2.3 中藥提取物與化學(xué)殺菌劑復(fù)配對(duì)小麥赤霉病菌的毒力測(cè)定 選擇9種中藥提取物中對(duì)小麥赤霉病菌絲生長(zhǎng)抑制效果相對(duì)較好的中藥提取物與3種化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。化學(xué)農(nóng)藥與中藥提取物按有效成分1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的比例復(fù)配，再按1.2.2 的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)抑制率求出毒力回歸方程，計(jì)算各藥劑對(duì)小麥赤霉病的抑制中濃度EC50，得出不同配比對(duì)小麥赤霉病的毒力，并計(jì)算共毒系數(shù)(CTC)，評(píng)價(jià)藥劑混用的效果。CTC≤80為拮抗作用，80

單劑毒力指數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)藥劑EC50/供試單劑EC50)×100

CTC=(ATI/TTI)×100

ATI=(標(biāo)準(zhǔn)藥劑EC50/供試混劑EC50)×100

TTI=藥劑A的毒力指數(shù)×混劑中A藥劑的百分含量+藥劑B的毒力指數(shù)×混劑中B藥劑的百分含量

式中，ATI為混劑實(shí)測(cè)毒力指數(shù)，TTI為混劑理論毒力指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)，DPS 7.05 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種中藥提取物對(duì)小麥赤霉病菌絲生長(zhǎng)的抑制率

從表1看出，不同濃度中藥提取物對(duì)小麥赤霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果存在差異。濃度為10 μg/mL時(shí)，對(duì)小麥赤霉病菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為-33.95%～-7.89%，均<0，表明，9種中藥提取物低濃度下對(duì)小麥赤霉菌絲生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)小麥赤霉病菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為-17.0%～31.66%，其中，黃岑片、黃連片、丹參和苦參4種中藥提取物的抑菌效果相對(duì)較好，分別為18.31%、20.65%、27.56%和31.66%。濃度為1 000 μg/mL時(shí)，除五倍子提取物的抑菌率為95.82%外，其余植物提取物的抑制率均達(dá)100%。綜合看，黃岑片、黃連片、丹參和苦參4種中藥提取物對(duì)小麥赤霉病菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果最好。因此，選擇這4種中藥提取物與3種化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行后續(xù)復(fù)配試驗(yàn)。

表1 9種中藥提取物對(duì)小麥赤霉病菌絲的抑制率 Table 1 Inhibition rate of 9 traditional Chinese medicine extracts against F. graminarum of wheat scab

2.2 中藥提取物及化學(xué)殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌的敏感性

從表2看出，4種中藥提取物及3種化學(xué)殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌的毒力存在差異。中藥提取物：黃岑片、苦參、丹參和黃連片的毒力回歸方程分別為yhc=0.917 5+1.697 3x、yk=1.622 7+2.139 6x、yds=0.515 3+0.612 5x和yhl=0.108 2+2.761 0x，對(duì)小麥赤霉病菌菌絲的EC50為37.89～61.42 μg/mL?；瘜W(xué)殺菌劑：戊唑醇、丙硫唑和多菌靈的毒力回歸方程分別為yw=5.170 6+1.446 9x、yb=4.001 0+1.697 3x和ydj=5.118 7+4.016 5x，對(duì)小麥赤霉病菌菌絲的EC50為0.76～3.88 μg/mL。

表2 4種中藥提取物及3種化學(xué)殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌的敏感性Table 2 Sensitivity of four traditional Chinese medicine extracts and three chemical fungicides against Fusarium graminarum of wheat scab

2.3 戊唑醇與4種中藥提取物復(fù)配對(duì)小麥赤霉病菌的毒力

從表3可知，戊唑醇與黃岑片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為2.14～47.88 μg/mL，以1∶1最小，為2.14 μg/mL，1∶40最大，為47.88 μg/mL；共毒系數(shù)為36.43～70.16，均<80，呈拮抗作用。戊唑醇與苦參提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為1.94～29.40 μg/mL，以1∶1最小，為1.94 μg/mL，1∶40最大，為29.40 μg/mL；共毒系數(shù)為58.81～79.22，均<80，呈拮抗作用。戊唑醇與丹參提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為2.20～24.62 μg/mL，以1∶1最小，為2.20 μg/mL，1∶40最大，為24.62 μg/mL；共毒系數(shù)為68.10～79.91，均<80，呈拮抗作用。戊唑醇與黃連片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為1.99～23.39 μg/mL，以1∶1最小，為1.99 μg/mL，1∶40最大，為23.39 μg/mL；共毒系數(shù)為59.92～87.98，除1∶40(87.98)>80呈相加作用外，其余復(fù)配比例均<80，呈拮抗作用。

表3 戊唑醇與植物提取物復(fù)配對(duì)小麥赤霉病菌的毒力Table 3 Virulence of tebuconazole compounded with 4 Chinese traditional medicine extracts against F. graminarum of wheat scab

2.4 丙硫唑與4種中藥提取物復(fù)配對(duì)小麥赤霉病菌的毒力

從表4可知，丙硫唑與黃岑片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為12.01～52.13 μg/mL，以1∶1最小，為12.01 μg/mL，1∶40最大，為52.13 μg/mL；共毒系數(shù)為60.77～89.98，其中1∶5(88.68)和1∶40(89.98)均>80，呈相加作用，其余復(fù)配比例均<80，呈拮抗作用。丙硫唑與苦參提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為7.38～48.62 μg/mL，以1∶1最小，為7.38 μg/mL，1∶40最大，為48.62 μg/mL；共毒系數(shù)為64.20～95.38，除1∶1>80(95.38)呈相加作用外，其余復(fù)配比例均<80，呈拮抗作用。丙硫唑與丹參提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為13.67～52.41 μg/mL，以1∶1最小，為13.67 μg/mL，1∶40最大，為52.41 μg/mL；共毒系數(shù)為48.26～77.06，均<80，呈拮抗作用。丙硫唑與黃連片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為12.72～47.94 μg/mL，以1∶1最小，為12.72 μg/mL，1∶20最大，為47.94 μg/mL；共毒系數(shù)為57.25～97.17，除1∶40(97.17)>80呈相加作用外，其余復(fù)配比例均<80，呈拮抗作用。

表4 丙硫唑與植物提取物復(fù)配對(duì)小麥赤霉病菌的毒力Table 4 Virulence of albendazole compounded with 4 Chinese traditional medicine extracts against F. graminarum of wheat scab

2.5 多菌靈與4種中藥提取物復(fù)配對(duì)小麥赤霉病菌的毒力

從表5看出，多菌靈與黃岑片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為2.09～26.83 μg/mL，以1∶1最小，為2.09 μg/mL，1∶40最大，為26.89 μg/mL；共毒系數(shù)為76.46～88.51，其中1∶1(87.67)和1∶40(88.51)均>80，呈相加作用，其余復(fù)配比例均<80，呈拮抗作用。多菌靈與苦參提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為2.04～30.96 μg/mL，以1∶1最小，為2.04 μg/mL，1∶40最大，為30.96 μg/mL；共毒系數(shù)為62.15～96.88，1∶1(88.99)和1∶5(96.88)均>80，呈相加作用外，其余復(fù)配比例均<80，呈拮抗作用。多菌靈與丹參提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為3.32～37.81 μg/mL，以1∶1最小，為3.32 μg/mL，1∶40最大，為37.81 μg/mL；共毒系數(shù)為55.04～74.89，均小于80，呈拮抗作用。多菌靈與黃連片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50為2.20～36.76 μg/mL，以1∶1最小，為2.20 μg/mL，1∶40最大，為36.76 μg/mL；共毒系數(shù)為63.67～83.57，其中，1∶1(83.24)、1∶5(83.57)和1∶20(81.22)均>80，呈相加作用，其余復(fù)配比例均<80，呈拮抗作用。

表5 多菌靈與植物提取物復(fù)配對(duì)小麥赤霉的協(xié)同作用Table 5 Virulence of carbendazim compounded with 4 Chinese traditional medicine extracts against Fusarium graminaru of wheat scab

3 討論

紀(jì)明山等[12]研究表明，丹參等20種中藥對(duì)小麥赤霉病有不同程度的抑制作用。趙恭文等[13]發(fā)現(xiàn)，黃岑等16種中草藥提取物對(duì)禾谷鐮孢菌等植物病原真菌有一定的抑制效果。楊阿麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿等生物藥劑與戊唑醇等化學(xué)農(nóng)藥組合使用可明顯提高病原菌的抑制率，可作為高效、低毒的混合型藥劑應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。研究結(jié)果表明，不同濃度中藥提取物對(duì)小麥赤霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果存在差異性，濃度為10 μg/mL和100 μg/mL時(shí)，對(duì)小麥赤霉病菌絲生長(zhǎng)的抑菌率分別為-33.95%～-7.89%和-17.0%～31.66%，1 000 μg/mL時(shí)，除五倍子提取物的抑菌率為95.82%外，其余植物提取物的抑制率均達(dá)100%。戊唑醇、丙硫唑和多菌靈與黃岑片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的EC50分別為2.14～47.88 μg/mL、12.01～52.13 μg/mL和2.09～26.83 μg/mL，與苦參提取物復(fù)配的EC50分別為1.94～29.40 μg/mL、7.38～48.62 μg/mL和2.04～30.96 μg/mL，與丹參提取物復(fù)配的EC50分別為2.20～24.62 μg/mL、13.67～52.41 μg/mL和3.32～37.81 μg/mL，與黃連片提取物復(fù)配的EC50為1.99～23.39 μg/mL、12.72～47.94 μg/mL和2.20～36.76 μg/mL。戊唑醇、丙硫唑和多菌靈與黃岑片提取物不同復(fù)配比例對(duì)小麥赤霉病菌的共毒系數(shù)分別為36.43～70.16、60.77～89.98和76.46～88.51，與苦參提取物復(fù)配的共毒系數(shù)分別為58.81～79.22、62.15～96.88和62.15～96.88，與丹參提取物復(fù)配的共毒系數(shù)分別為68.10～79.91、48.26～77.06和55.04～74.89，與黃連片提取物復(fù)配的共毒系數(shù)分別為59.92～87.98、57.25～97.17和63.67～83.57。其中，戊唑醇與黃連片提取物復(fù)配除1∶40對(duì)小麥赤霉病菌的作用效果呈相加作用，與其余復(fù)配比例以及其余中藥提取物各復(fù)配比例均呈拮抗作用；丙硫唑與黃岑片提取物復(fù)配比例為1∶5和1∶40、與苦參提取物復(fù)配比例為1∶1、與黃連片提取物復(fù)配比例為1∶40時(shí)對(duì)小麥赤霉病菌的作用效果為相加作用，與其余復(fù)配比例以及其余中藥提取物各復(fù)配比例均呈拮抗作用；多菌靈與黃岑片提取物復(fù)配比例為1∶1和1∶40、與苦參提取物復(fù)配比例為1∶1和1∶5、與黃連片提取物復(fù)配比例為1∶1和1∶5對(duì)小麥赤霉病菌的作用效果為相加作用，與其余復(fù)配比例以及其余中藥提取物各復(fù)配比例均呈拮抗作用，研究結(jié)果與前人報(bào)道結(jié)論相近。研究?jī)H進(jìn)行了室內(nèi)抑菌活性測(cè)定，中藥提取物作為助劑在田間使用表現(xiàn)有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，且小麥赤霉病由多種鐮刀菌引起，黃岑片、苦參、丹參和黃連片提取物對(duì)其他小麥赤霉病菌的毒力作用仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

黃岑片、黃連片、丹參和苦參4種中藥提取物作為戊唑醇、丙硫唑和多菌靈的增效助劑時(shí)各比例EC50分別為1.94～47.88 mg/L、7.38～52.41 mg/L和2.04～37.81 mg/L。