基于線粒體D-loop區(qū)和Cyt b基因序列的四川裂腹魚養(yǎng)殖群體遺傳多樣性

劉 偉，曾 圣，王 雪，詹會祥，周 路，熊 畔，向 燕

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所，貴陽 550025；2.畢節(jié)市水產(chǎn)技術推廣站，貴州 畢節(jié) 551700；3. 畢節(jié)市鑫有農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限責任公司，貴州 畢節(jié) 551700)

【研究意義】四川裂腹魚(Schizothoraxkozlovi)隸屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科(Schizothoracinae)，主要分布在長江上游金沙江、雅礱江、烏江上游和北盤江[1]，為長江上游特有魚類，亦是高原魚類區(qū)系重要種類，具有較高的科研價值。四川裂腹魚肉質(zhì)細嫩，不飽和脂肪酸豐富[2]，食用價值較高。近年來，受人為因素的影響，四川裂腹魚野生群體數(shù)量及分布區(qū)域急劇減少，捕獲的個體偏小型化和低齡化[3-4]，被《中國脊椎動物紅色名錄》列為易危種(Vulnerable，VU)[5]。2011年畢節(jié)市水產(chǎn)技術推廣站率先突破四川裂腹魚的人工繁殖及魚苗培育技術[2]，隨后向貴州部分適養(yǎng)地區(qū)擴散，目前該土著魚類已列入貴州省生態(tài)漁業(yè)中冷水魚養(yǎng)殖新品種，養(yǎng)殖效益高、前景廣闊。魚類群體的適應能力、生存、進化能力與其群體遺傳多樣性緊密相關[6]，近年來，魚類養(yǎng)殖群體遺傳多樣性降低引起種質(zhì)退化而導致的養(yǎng)殖問題層出不窮，如魚苗成活率降低、魚體病害增多等，嚴重影響?zhàn)B殖效益。因此，研究四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，制定人工選育策略，對其產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】線粒體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單和變異速度快等特點，是群體遺傳研究的理想分子標記[7]，其中D-loop區(qū)為非編碼區(qū)受自然選擇壓力小，變異速率較大，Cytb基因編碼蛋白質(zhì)較為保守，目前這兩種基因標記在裂腹魚亞科魚類野生群體遺傳學研究中已有廣泛應用?；贒-loop區(qū)研究方面，代應貴等[8]研究表明，烏江上游六沖河河段四川裂腹魚群體的遺傳多樣性匱乏；陳永祥[3]的分析顯示，烏江上游總稽河段等4個四川裂腹魚地理群體間的遺傳分化較高；海薩·艾也力汗等[9]的結(jié)果表明，塔里木河群體遺傳多樣性較為豐富，而車爾臣河群體遺傳多樣性偏低，并建議將2個群體分開管理?；贑ytb基因研究方面，俞丹等[10]認為，雅魯藏布江下游墨脫江段及察隅河的墨脫裂腹魚群體間缺少基因交流，遺傳分化度較高；張爭世等[11]研究認為，長江上游齊口裂腹魚群體的遺傳多樣性處于中等水平；婁晉銘等[12]分析了甘肅省 3 種裂腹魚類遺傳多樣性結(jié)果顯示，3種裂腹魚類同一種的不同地理群體間遺傳分化明顯。【本研究切入點】四川裂腹魚是貴州省生態(tài)漁業(yè)的新興土著魚類養(yǎng)殖品種，開展其養(yǎng)殖群體遺傳多樣性研究十分必要，但至今未見四川裂腹魚養(yǎng)殖群體遺傳研究的相關報道?！緮M解決的關鍵問題】通過對貴州畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖群體D-loop區(qū)和Cytb基因的測定和分析，研究其群體遺傳多樣性，旨在了解該地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的種質(zhì)狀況，為其選育和遺傳改良工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年3月，于貴州省大方縣光富生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司流水養(yǎng)殖池隨機挑選35尾無畸形的體重約0.1～1.0 kg的四川裂腹魚活魚，剪取部分尾鰭置于無水乙醇中用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用北京擎科新業(yè)生物科技有限公司提供的“通用型硅膠膜法動物基因組提取試劑盒”進行基因組DNA提取，操作方法參照說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.2.2 PCR擴增 Cytb基因PCR擴增的引物為通用引物L14724、H15915[13]，D-loop區(qū)引物參照文獻[8]。PCR擴增總體系30 μL，包含上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、基因組DNA 1 μL、PCR Master Mix 15 μL、ddH2O 12 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性3 min;98 ℃變性10 s，55 ℃(Cytb基因)/60 ℃(D-loop區(qū))退火15 s，72 ℃延伸15 s，39個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR效果。

1.2.3 序列測定與分析 委托北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行雙向測序(測序引物與擴增引物一致)并拼接，序列用Clustalx 1.83軟件進行比對，剪去兩端測序信號不穩(wěn)定的堿基。通過DNASP 6.0軟件統(tǒng)計四川裂腹魚養(yǎng)殖群體遺傳多樣性參數(shù)，對群體進行Tajima’s D中性檢驗，對D-loop區(qū)和Cytb基因序列進行核苷酸錯配分布(Mismatch distribution)分析。用MEGA 5.0軟件計算堿基組成、Kimura-2-parameter模型的遺傳距離，分別構(gòu)建兩種序列單倍型鄰接(Neighbor Joining，NJ)系統(tǒng)樹(1000次抽樣bootstrap檢驗)；采用PMAL 4.3 軟件中的Codeml程序檢測四川裂腹魚養(yǎng)殖群體Cytb基因受選擇壓力的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-loop區(qū)和Cyt b序列片段特征與變異

從表1可知，35尾四川裂腹魚個體最終獲得469 bp的D-loop區(qū)序列和1076 bp的Cytb基因序列， 2種基因序列堿基A+T平均含量均高于G+C，符合硬骨魚類線粒體基因的堿基組成；Cytb基因密碼子第一位上4種堿基使用頻率差異不大，密碼子第二位上表現(xiàn)出明顯的T(42.0%偏倚)和反G(13.1%)偏倚，密碼子第三位C、A使用頻率明顯高于T、G。

D-loop區(qū)和Cytb基因序列分別檢測到9個和34個核苷酸多態(tài)位點，及7和8種單倍型(表2～3)。D-loop區(qū)未發(fā)現(xiàn)插入或缺失位點，9個多態(tài)位點均為轉(zhuǎn)換位點(A-G轉(zhuǎn)換7個，C-T轉(zhuǎn)換2個)； Cytb基因序列的34個多態(tài)位點中，轉(zhuǎn)換位點有31個，其中A-G轉(zhuǎn)換18個，C-T轉(zhuǎn)換13個，顛換位點3個，平均轉(zhuǎn)顛換比為10.33，2種序列的多態(tài)位點中轉(zhuǎn)換明顯大于顛換，說明2種序列的轉(zhuǎn)換和顛換均未達飽和狀態(tài)。此外，Cytb基因密碼子第一、二、三位點上出現(xiàn)的變異位點數(shù)分別為3、3、28個，分別占總研究序列的2.6%、0.28%、0.28%，第三位點變異率明顯高于第一、二位點(表1)。

表2 四川裂腹魚不同單倍型D-loop區(qū)序列多態(tài)位點分布

表3 四川裂腹魚不同單倍型Cyt b基因序列多態(tài)位點分布

2.2 群體遺傳多樣性

DnaSP 6.0分析結(jié)果顯示，基于D-loop區(qū)和Cytb基因序列四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)分別為0.765和0.842、0.00 519和0.00 826、2.434和8.881，可見，基于D-loop區(qū)序列的各項遺傳多樣性指標均明顯低于Cytb基因序列。

2.3 群體遺傳分化

四川裂腹魚養(yǎng)殖群體D-loop區(qū)序列7種單倍型間的遺傳距離為0.0021～0.0131，平均遺傳距離為0.0083；Cytb基因序列8種單倍型間的遺傳距離為0.0019～0.0189，平均遺傳距離為0.01。說明基于Cytb基因序列單倍型間的遺傳分化程度較D-loop區(qū)序列單倍型間的高。

從圖1可知，構(gòu)建的2種序列單倍型NJ系統(tǒng)樹存在多歧分支。D-loop區(qū)序列單倍型Hap5和Hap4聚為一支，代表5個個體。Hap6 和Hap7聚為一支，代表5個個體；Hap1和 Hap2先聚為一支再和 Hap3聚為一支，代表24個個體，為優(yōu)勢分支。Cytb基因序列單倍型Hap3、 Hap4、Hap5、 Hap6、Hap7聚為一支， Hap1和Hap8聚為一支，Hap2單獨為一支，3個分支分別代表15、7和12個個體，無明顯的優(yōu)勢分支。

圖1 基于D-loop區(qū)(A)和Cyt b(B)序列單倍型間遺傳距離的四川裂腹魚養(yǎng)殖群體NJ系統(tǒng)樹Fig.1 NJ tree of the farmed S. kozlovi based on genetic distances for haplotypes of D-loop region and Cyt b genes

中性檢測分析結(jié)果顯示，基于D-loop區(qū)和Cytb基因序列的四川裂腹魚養(yǎng)殖群體Tajima’s D正值，分別為0.34 119(P>0.05)和0.26 868(P>0.05)；對2種基因序列進行核苷酸錯配分布分析，結(jié)果均呈多峰分布(圖2)，表明四川裂腹魚養(yǎng)殖群體歷史上未經(jīng)歷群體擴張事件，群體大小趨于穩(wěn)定[14]。

圖2 四川裂腹魚養(yǎng)殖群體核苷酸錯配分布曲線Fig.2 The nucleotide mismatch distribution curve of the farmed S. kozlovi

2.4 四川裂腹魚養(yǎng)殖群體選擇壓力

為了解四川裂腹魚養(yǎng)殖群體受選擇壓力的情況，本研究分析了Cytb基因受選擇壓力影響的情況，結(jié)果顯示，Cytb基因序列變異中非同義突變(dN)與同義突變(dS)的比值dN/dS 為0.1 724(P>0.05)，表明Cytb基因序列中的堿基突變存在非同義突變，突變導致了氨基酸的變異。通常認為dN/dS> 1時，基因受正向選擇的影響，而dN/dS < 1時，基因受純化或負向選擇的影響[15]，因此，四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的Cytb基因可能受到負向選擇。

表4 裂腹魚亞科部分魚類遺傳多樣性比較結(jié)果

3 討 論

對畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖群體D-loop區(qū)和Cytb基因序列片段分析表明，A+T含量均明顯高于G+C含量，這與塔里木裂腹魚[9]、墨脫裂腹魚[10]、齊口裂腹魚[11]等的研究結(jié)果相似。同時，Cytb基因密碼子第二位上表現(xiàn)出明顯的T(42.0%)偏倚和反G(13.1%)偏倚、密碼子第三位C、A使用頻率明顯高于T、G等特征與鲇、斑鳠[15]的研究結(jié)果相似，這種密碼子上的堿基偏倚性被認為是魚類Cytb基因的一個典型特征[16]。四川裂腹魚養(yǎng)殖群體D-loop區(qū)序列變異率(1.9%)較Cytb基因序列(3.16%)的低，這與魚類線粒體D-loop區(qū)變異速率高于Cytb基因的一般規(guī)律不符合。有研究表明，鯉科魚類D-loop區(qū)不同區(qū)域變異程度不同，變異一般主要集中在D-loop區(qū)的兩側(cè)，中間區(qū)域相對保守[17]，通過與NCBI下載的四川裂腹魚D-loop全序列(937 bp，登錄號為KU868078.1)對比，本研究序列(469 bp)位于全序列的中間區(qū)域(230 ～730 nt)，因而所獲序列變異程度較低；所獲Cytb基因序列(1075 bp)基本為全序列(1140 bp)，且變異程度較D-loop區(qū)更高，因此，Cytb基因更適合作為本研究的分子標記。此外，Cytb基因的變異多位于密碼子第3位點上，其變異率(2.6%)顯著高于第一、二位(0.28%、0.28%)，原因是密碼子第三位點受自然選擇壓力較小導致變異更快[18]。

遺傳多樣性是物種生存和進化的基礎，遺傳多樣性越豐富，其生存和競爭能力就越強。單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣性(π)是衡量物種遺傳多樣性的2個重要指標，Hd和π值越高，其遺傳多樣性越豐富[19]。本研究四川裂腹魚養(yǎng)殖群體D-loop區(qū)和Cytb基因序列的Hd、π分別為0.765、0.00 519和 0.842、0.00 826，與裂腹魚亞科部分種類群體的遺傳多樣性對比發(fā)現(xiàn)，基于D-loop區(qū)序列的四川裂腹魚養(yǎng)殖群體Hd和π較烏江群體四川裂腹魚[8]和多浪渠首等5個群體塔里木裂腹魚[20]的高，而較庫瑪拉克河等7個群體塔里木裂腹魚[9]和6個野生群體嘉陵裸裂尻魚(Schizopygopsiskialingensis)[21]低；基于Cytb基因序列的四川裂腹魚養(yǎng)殖群體Hd和π較黃河裸裂尻魚(S.pylzovi)和嘉陵裸裂尻魚[12]、墨脫裂腹魚[10]的高，而較祁連裸鯉(Gymnocyprischilianensis)[12]和齊口裂腹魚[11]的低。因此，本研究四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性在裂腹魚亞科魚類種類群體中處于中等水平。根據(jù)Grant 等[22]提出的Hd和π的4種模式，本研究四川裂腹魚養(yǎng)殖群體D-loop區(qū)和Cytb基因序列的Hd和π的結(jié)果均符合第4種模式，即較高Hd(Hd>0.5)和較高π(π≥0.5%)，說明該群體可能是由一個大而穩(wěn)定的群體經(jīng)歷較長的歷史演化或是2個較大種群發(fā)生第2次接觸形成；2種基因序列的核苷酸錯配分布顯示多峰分布，且Tajima’s D中性檢測不顯著(P>0.05)，說明該群體近期歷史上未發(fā)生種群擴張事件，群體大小穩(wěn)定。

NJ系統(tǒng)樹存在多歧分布，35個四川裂腹魚個體散布在系統(tǒng)樹的各分支間，且各分支的置信值較高，推測這35個個體可能來源于3個母系。烏江上游干流—六沖河地形地貌復雜，河谷深切，水流湍急，山地形成的急流長峽非常適合裂腹魚類的生存，加之近年來烏江梯級水電的開發(fā)[4]，生活在六沖河的魚類極易產(chǎn)生地理隔離，畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖親魚捕自六沖河[23]，后又陸續(xù)從河流中補充了野生個體[4]，因此，從六沖河捕獲的四川裂腹魚親本可能來自不同的母系群體，遺傳分化較大，這可能也是其人工繁育后代提供了遺傳多樣性豐富的原因。綜上，畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較為豐富。

從進化角度看，養(yǎng)殖群體的遺傳變異往往是其生存環(huán)境和人工選擇協(xié)同作用的結(jié)果。在魚類的人工養(yǎng)殖和繁育過程中，包含著有意或無意的人工選擇，基因所受的選擇壓力往往使部分位點發(fā)生遺傳變異[24]，而在生存環(huán)境相對穩(wěn)定的情況下，基因更多偏向負向選擇[25]。畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的Cytb基因可能受到負向選擇(dN/dS≈0.17<1)，暗示人工選擇壓力對當前四川裂腹魚養(yǎng)殖群體Cytb基因的影響有限，這與河南鳙養(yǎng)殖群體線粒體COI基因選擇壓力分析的研究結(jié)果相似[26]，下一步的研究需要選擇更多的基因去檢驗畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的選擇壓力。雖然畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較高，但長期的負向選擇容易導致群體遺傳衰退，因此，應加強不同世代四川裂腹魚養(yǎng)殖群體遺傳多樣性監(jiān)測，在補充親本的同時先了解其遺傳背景，注意加強引種數(shù)量和范圍；另外，為了提高四川裂腹魚的養(yǎng)殖效益，應采取家系選育等高效的選育手段，選育出生長更快、性狀優(yōu)良、適應性強、宜推廣的優(yōu)良品系。

4 結(jié) 論

Cytb更適合作為畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚遺傳多樣分析的分子標記。畢節(jié)地區(qū)四川裂腹魚群體近期歷史上可能未經(jīng)歷群體擴張事件，而是由一個大而穩(wěn)定的群體經(jīng)歷較長的歷史演化，具有較為豐富的遺傳多樣性；群體選擇壓力可能受到負向選擇的影響，當前的人工選擇對Cytb基因的影響有限。