馬鈴薯StWRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆和生物信息學(xué)分析

劉子剛，田佩耕，王 寧，翟鑫娜，張?jiān)茙?，劉毅?qiáng)，武佳穎，田再民，魏 東,2

(1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000)

【研究意義】馬鈴薯是全球第四大重要的糧食作物，馬鈴薯的生產(chǎn)受到多種環(huán)境脅迫的影響，如極端溫度、水澇及高鹽脅迫是影響植株生長發(fā)育的重要因素。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，植物抗逆機(jī)理的研究逐漸步進(jìn)入分子水平。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)又稱反式作用因子，是一種DNA結(jié)合蛋白，它可以與基因5′端上游特定序列特異性結(jié)合[1]。它對目的基因的轉(zhuǎn)錄起著增強(qiáng)和阻遏的作用[2]，因此對轉(zhuǎn)錄因子的研究是從分子層次上認(rèn)識植物抗逆機(jī)制的基礎(chǔ)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物響應(yīng)非生物病害及非生物脅迫的調(diào)控途徑中發(fā)揮著重要的作用[3]。【前人研究進(jìn)展】WRKY蛋白結(jié)構(gòu)基本含有1～2個WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域約由60個高度保守的氨基酸殘基組成，包括位于N端的WRKYGQK七肽序列和位于C端的鋅指結(jié)構(gòu)。因其位于N末端的WRKYGQK保守核心序列而得名，位于C端的序列由 C2H2或 C2HC 型鋅指結(jié)構(gòu)組成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY基因在植物體內(nèi)受許多脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá)，且具有組織特異性[5-6]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合目的基因W-box的WRKY結(jié)構(gòu)域，W-box主要位于植物抗逆、損傷和衰老相關(guān)基因的啟動子區(qū)[7-8]，因此WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠參與植物體內(nèi)生物與非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制。經(jīng)NaCl脅迫處理及qRT-PCR 顯示，擬南芥根中有18個AtWRKY基因誘導(dǎo)表達(dá)[9]，轉(zhuǎn)錄組分析表明水稻中的41個OsWRKY基因、擬南芥中的20個AtWRKY基因和油菜中的74個BnWRKY基因參與植物非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制，但其誘導(dǎo)表達(dá)模式存在差異，說明這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子在各種逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[10-11]。【本研究切入點(diǎn)】目前對WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究在多個模式植物中較多，但在馬鈴薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的作用及下游蛋白的調(diào)控等方面研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文從馬鈴薯中克隆獲得StWRKY基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用PCR分析在不同組織中的表達(dá)，進(jìn)一步通過鹽脅迫和干旱脅迫試驗(yàn)初步鑒定了StWRKY基因的功能，本試驗(yàn)初步闡明了StWRKY基因在脅迫應(yīng)答中的作用，該研究對進(jìn)一步認(rèn)識馬鈴薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冀張薯12號馬鈴薯組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成: 取幼嫩的組培苗葉片0.5 g，采用黃國文等[12]的方法提取總RNA。以馬鈴薯總RNA為模版，參考諾唯贊cDNA第一鏈的合成說明書，加入3 μL的反轉(zhuǎn)錄酶，3 μL模板RNA (終濃度1500 ng)，7 μL RT reaction buffer，加ddH2O定容至20 μL。然后進(jìn)行離心后，于PCR儀中42 ℃，15 min。

馬鈴薯StWRKY和StWRKY6基因PCR擴(kuò)增程序: ①馬鈴薯WRKY基因的引物設(shè)計(jì)。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。StWRKY-F的引物序列(5′-3′)為CTCTCCACTTTTACATTCTCAG；StWRKY-R的引物序列(5′-3′)為GCCTTACTAGGCATTGAAAG。②馬鈴薯WRKY基因PCR擴(kuò)增程序。擴(kuò)增總體積為50 μL，其中2×Vazyme Lamp Master Mix 25 μL，模板DNA 1 μL，StWRKY-F(10 μmol/L) 2 μL，StWRKY-R (10 μmol/L) 2 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃下預(yù)變性5 min;然后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，在50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，持續(xù)35個循環(huán)后;將其在72 ℃下延伸7 min，最后4 ℃保存。

馬鈴薯WRKY基因擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：利用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行檢測。

生物信息學(xué)分析：使用NCBI完成WRKY基因的ORF查找和氨基酸序列的分析；用ProtParam工具完成蛋白分子量和理論等電點(diǎn)的分析；用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；用Expasy工具完成蛋白疏水性分析；使用TMHMM Server完成蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測；使用SOPMA構(gòu)建蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；用Expasy工具構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

實(shí)時定量PCR：利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)的熒光定量上游引物和下游引物，引物序列如下：StWRKY-F：5′-CTAATGGCAAGCATGGAAACTCCAA-3′，StWRKY-R ：5′-CTTGGCTCCTTGTTTGGAAAGCATA-3′；用反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 稀釋10倍作為熒光定量模板，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin，引物序列如下：Actin-F：5′-CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′，Actin-R：5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′。參照Trans Start Top Green qPCR Super Mix (Transgen)說明進(jìn)行RT-qPCR分析。采用 2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 StWRKY基因的克隆和編碼氨基酸序列分析

以馬鈴薯cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在747 bp處有目標(biāo)條帶(圖1)。該基因共編碼了248個氨基酸(圖2)。

圖1 StWRKY基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of StWRKY gene

圖2 StWRKY基因cDNA序列及編碼氨基酸序列Fig.2 StWRKY gene cDNA sequences and coding amino acid sequences

2.2 StWRKY蛋白序列比對和進(jìn)化樹的構(gòu)建

在NCBI中利用BLAST查找其他物種WRKY基因編碼的同源蛋白序列進(jìn)行比對，馬鈴薯WRKY基因與潘那利番茄(Solanumpennellii)(XP015075730.1)同源性最高達(dá)到了97.1%；中華辣椒(Capsicumchinense)(PHU02980.1)同源性達(dá)到了79.1%；毛酸漿(Physalispubescens)(AZB50357.1)同源性達(dá)到了79.1%；與風(fēng)鈴辣椒(Capsicumccatum)(PHT34361.1)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis)(XP009615508.1)、紅梅(Prunusmume)(XP008222197.1)的同源性分別達(dá)到了82.4%、67.2%、62.2%。通過DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3所示。該進(jìn)化樹被分為2組(GroupsⅠ和GroupsⅡ)，GroupsⅠ有7個WRKY蛋白(StWRKY、SlWRKY、SpWRKY、NtWRKY、PpWRKY、CbWRKY、CcWRKY)，GroupsⅡ有一個WRKY蛋白(PmWRKY)，StWRKY蛋白和GroupsⅠ中的SlWRKY蛋白相似度最高達(dá)到97.1%，且與同屬茄科的SlWRKY、SpWRKY處于同一分支；反之與煙草，辣椒的系統(tǒng)發(fā)育距離較遠(yuǎn)[13]。通過DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中馬鈴薯WRKY基因與番茄WRKY基因在同一支上，親緣關(guān)系最近，其次是煙草、毛酸漿、辣椒，為茄科植物在一個大分支內(nèi)；紅梅在另一個分支內(nèi)。馬鈴薯WRKY基因與番茄WRKY基因在同一支上，親緣關(guān)系較近。

圖3 StWRKY的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of StWRKY

2.3 StWRKY的蛋白分子量和理論等電點(diǎn)分析

通過ProtParam軟件(網(wǎng)址:http://www.expasy.org/tools/protparam.html)在線預(yù)測并分析StWRKY蛋白質(zhì)的性質(zhì)，分析結(jié)果表明StWRKY蛋白共有172個氨基酸，分子量19 921.58，理論等電點(diǎn)9.22，帶負(fù)電殘基總數(shù)21，帶正電殘基總數(shù)28，不穩(wěn)定系數(shù)40.56，為不穩(wěn)定蛋白。

2.4 StWRKY的蛋白親水性和疏水性分析

利用Expasy工具(http://au.expasy.ch/tools/protscale.html)中的ProtScale軟件在線分析氨基酸的親水以及疏水性。StWRKY蛋白質(zhì)的親水性分析，由圖4可知，StWRKY平均親水系數(shù)為-0.836，為親水性蛋白。

圖4 StWRKY蛋白的親水性分析Fig.4 Hydrophilicity analysis of StWRKY protein

2.5 StWRKY蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA(網(wǎng)址：http:pbil.ibcp.fr/)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。如圖5所示，StWRKY蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)曲線(69個)為主，占40%；其次為α-螺旋(64個)，占37.3%；伸展鏈(26個)，占15.1%；β-折疊(13個)，僅占7. 6%。

通過在線網(wǎng)址(http://www.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，獲得StWRKY蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)圖，從圖6可以看出，具有5個折疊一個螺旋。

圖5 StWRKY蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of StWRKY protein

圖6 StWRKY蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of tertiary structure of StWRKY protein

2.6 StWRKY蛋白序列跨膜區(qū)預(yù)測

通過TMHMM工具(在線網(wǎng)址:www.cbs.dtu.dk/services/)進(jìn)行蛋白序列跨膜區(qū)預(yù)測圖，由圖7顯示，StWRKY蛋白的紫色線的概率趨近于1，屬于非跨膜蛋白。

圖7 StWRKY蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of WRKY protein transmembrane structure in potato

2.7 StWRKY在不同組織部位的表達(dá)模式分析

利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析StWRKY基因分別在根、莖、葉中的表達(dá)情況。由圖8可知，該基因的表達(dá)量由高到低依次是葉、根、莖。

圖8 StWRKY基因在不同組織部位的表達(dá)模式Fig.8 Expression pattern of StWRKY in different parts

2.8 StWRKY在脅迫下的表達(dá)分析

利用RT-qPCR分析StWRKY低溫能誘導(dǎo)的表達(dá)情況。由圖9可知，處理4 h后，StWRKY相對表達(dá)量明顯增加，約為對照的2.5倍，在處理6、8 h后，相對表達(dá)量沒有明顯變化，說明StWRKY在低溫誘導(dǎo)的早期響應(yīng)這一生理過程。

圖9 低溫脅迫下StWRKY基因表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of StWRKY gene under low temperature stress conditions

圖10 鹽脅迫下StWRKY基因表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of StWRKY gene under salt stress conditions

利用RT-qPCR分析StWRKY在鹽脅迫的誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。由圖10可知，處理3 h后StWRKY的相對表達(dá)量急劇上升，約為對照的6倍，處理7 h后，相對表達(dá)量到達(dá)高峰，在處理5、7、9 h后，相對表達(dá)量沒有明顯變化，說明StWRKY在鹽誘導(dǎo)的早期響應(yīng)這一生理過程。

3 討 論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是廣泛存在于植物中的一類重要蛋白，其可以在很多逆境脅迫中發(fā)揮作用減少逆境對植物帶來的傷害，因此對WRKY家族的研究至關(guān)重要。本試驗(yàn)對馬鈴薯StWRKY進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。StWRKY蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)曲線為主，StWRKY蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測比例為無規(guī)則卷曲>α-螺旋>伸展鏈>β-折疊，與番茄SpWRKY1、SpWRKY2、SpWRKY3的二級結(jié)構(gòu)的比例遵循相似[14]。StWRKY基因的平均親水系數(shù)為-0.836，為親水蛋白，親水蛋白中含有大量親水氨基酸，而過表達(dá)一些親水蛋白可以增強(qiáng)植株耐受干旱、低溫、高鹽等不利環(huán)境影響的能力[15]。

利用RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯StWRKY在低溫處理4 h后表達(dá)量顯著增加，且在處理6 h后表達(dá)量達(dá)到峰值，番茄WRKY基因在低溫處理2 h后表達(dá)量達(dá)到峰值，與馬鈴薯兩類WRKY基因的表達(dá)量均為先升后降[16]，煙草NtWRKY8在低溫處理6 h后表達(dá)量達(dá)到峰值，這說明WRKY基因在低溫誘導(dǎo)的早期響應(yīng)這一過程[17]，也有研究表明WRKY基因在低溫誘導(dǎo)時表達(dá)量呈現(xiàn)升—降—升的規(guī)律[18]。利用RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，StWRKY在鹽脅迫處理3 h后表達(dá)量顯著增加，玉米ZmWRKY53基因在鹽脅迫處理12h表達(dá)量達(dá)到峰值，與馬鈴薯StWRKY基因的表達(dá)量為先升后降，這與上述面對低溫溫脅迫時表達(dá)量變化較為一致[18]。通過同源蛋白比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StWRKY基因與茄科作物中的番茄同源性最高，番茄SlWRKY23通過上調(diào)SlRD22和SlDREB2A的表達(dá)量提高番茄耐鹽性[19]，番茄轉(zhuǎn)入SlWRKY53基因的植株對鹽脅迫的抗性明顯強(qiáng)于野生型[20]，研究表明番茄WRKY基因具有抵抗非生物脅迫的能力，能對低溫、干旱、高鹽脅迫具有耐受性[21]。

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，馬鈴薯StWRKY在葉和根中的表達(dá)相對較高，番茄SlWRKY23在變色期果實(shí)中的表達(dá)最高，在莖中的表達(dá)較低，根和葉比莖中的表達(dá)分別高5和7倍，這與馬鈴薯StWRKY基因的表達(dá)較為一致[19]，大豆GmWRKY28-like在根、種子中表達(dá)量較低，在葉、花和莖尖分生組織表達(dá)量較高[22]，玉米ZmWRKY53在根、葉中表達(dá)量較高[18]，番茄SlWRKY53在成熟莖中的表達(dá)最高，在幼莖和幼根中的表達(dá)相對較少[20]。WRKY基因在植株不同器官間表達(dá)差異與其生物學(xué)功能有關(guān)，馬鈴薯StWRKY轉(zhuǎn)錄因子在葉中的表達(dá)較高可能與其通過調(diào)控脫落酸參與植物非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)，脫落酸是一種植物激素，可以調(diào)節(jié)植物面對非生物脅迫時的反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)脫落酸受體ABAR位于細(xì)胞質(zhì)的C端能夠和數(shù)個WRKY轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用[23]，擬南芥WRKY31受脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)[24]，過表達(dá)擬南芥OsWRKY45的突變體植株經(jīng)水分脅迫后能夠關(guān)閉更多氣孔，降低植株體內(nèi)水分減少的速度，使水分能夠維持更好地平衡[25]，WRKY57通過提高ABA水平增加擬南芥的耐旱性[26]，另一方面也有可能通過改善適應(yīng)性氧化物來提高植株的抗逆性[27]。

4 結(jié) 論

馬鈴薯StWRKY基因受低溫脅迫和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，番茄WRKY44和WRKY1基因在鹽脅迫方面起重要作用[28]，SpWRKY6轉(zhuǎn)錄因子有提高抗煙草疫霉的功能[29]，綜上所述，初步證明StWRKY基因在馬鈴薯面對各種逆境脅迫時可以發(fā)揮重要作用，為了更好地揭示StWRKY轉(zhuǎn)錄因子的具體功能，未來還需進(jìn)一步研究。