鎘脅迫下不同生態(tài)型魚腥草生長及生理特性的響應

吳正卓，劉桂華，范成五，吳科堰，秦 松

(1.貴州省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，貴陽 550081；2.貴州省農業(yè)科學院土壤肥料研究所，貴陽 550006；3貴州大學農學院，貴陽 550025)

【研究意義】隨著工農業(yè)的快速發(fā)展，工業(yè)“三廢”排放量增大，固體廢棄物不合理處理，農業(yè)污水、廢水灌溉，劣質化肥的施用及大氣沉降致使土壤中重金屬污染問題日益嚴重[1-2]。調查顯示，我國耕地土壤污染點位超標率達19.4%，其中重金屬Cd的點位超標率最高，達7.0%[3]。2016年國務院頒布的《土壤污染防治行動計劃》重點監(jiān)測的土壤五大重金屬中Cd排首位。Cd對動植物都屬于非必需元素，而且具有較強的毒性，移動性強、中毒臨界濃度低、具積累效應，是環(huán)境中最危險的重金屬之一[4]。Cd濃度超過某一閾值時，會對植物產生毒害作用，這些作用可能包括抑制植物生長，降低凈光合速率，降低光合色素、酶活性降低、活性氧含量增加等[5-6]。因此，研究Cd脅迫傷害植物機理及Cd污染土壤的植物修復均具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】Cd對植物脅迫的研究已有一定的報道，如潭長強等[7]研究得出，Cd脅迫下顯著降低了臺灣愷木根、莖和葉鮮物質積累量；朱志勇等[8]研究表明，在低濃度Cd下，多數品種小麥幼苗鮮物質積累量增加，有促進作用，高濃度下，所有品種小麥生長受到明顯抑制。魚腥草(HouttuyniacasdataThunbs)，又名芩草、蕺草、臭腥草等，屬三白草科(Saururaceae)，其既是一種美味高營養(yǎng)的食材，又是一種多用途的優(yōu)質的中藥材[9]在貴州分布及種植廣泛，其中，貴陽市烏當區(qū)、安順市平壩區(qū)、畢節(jié)市等地區(qū)種植面積穩(wěn)定，年限較長，如烏當區(qū)魚腥草占據了貴陽市市場70%的份額，其產值為貴州扶貧工作發(fā)揮重要作用。魚腥草對土壤中部分重金屬具有一定富集能力，李錚錚等[10]研究顯示，魚腥草對Pb具有一定的耐性和富集能力，且大多學者研究主要集中于Pb及Pb與其他重金屬的交互作用對魚腥草吸收累積和魚腥草抗氧化酶系統(tǒng)及葉綠素的影響[10-13]。另外，眾多研究表明，由于產區(qū)土壤及氣候環(huán)境差異可能會使同一物種之間存在種質差異，進而可能會導致在生長過程中對重金屬元素的吸收和耐性不同[14-16]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對Cd脅迫處理對不同生態(tài)型魚腥草生理生化特性影響的研究相對較少。因此，對貴州不同產地魚腥草對Cd的耐受能力進行研究，以期為Cd脅迫傷害植物機理及Cd污染土壤的植物修復提供理論依據?！緮M解決的關鍵問題】研究側重闡明不同濃度Cd脅迫對3種生態(tài)型魚腥草生長的影響、葉片抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性變化及相對葉綠素含量等生理指標的響應規(guī)律，闡明不同產地魚腥草對Cd的耐受能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

魚腥草來自貴州省安順市平壩區(qū)(山間平地)、貴陽市烏當區(qū)(丘陵)和畢節(jié)市七星關區(qū)(高原山地)3個產區(qū)，于貴州省土壤肥料研究所試驗地種植1年，消除各地區(qū)土壤性質差異對魚腥草生理特性的影響，保證試驗材料基礎背景含量保持一致。試驗用石英砂為普通，粒徑2 mm，用水洗凈晾干，滅菌消毒待用。

1.2 試驗設計

Cd脅迫設6個水平，采用CdCl22.5H2O(分析純)以溶液形式加入供試石英砂中，脅迫處理濃度分別為0(CK)、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/kg，每種生態(tài)型魚腥草每個處理3次重復。砂培盆栽試驗在日光溫室大棚內開展，試驗用塑料盆直徑26.5 cm，高17.6 cm，石英砂預先用蒸餾水洗凈晾干，滅菌消毒，每盆裝石英砂1.5 kg(干重)，每盆平行栽植大小一致的6根魚腥草莖段(每段3個節(jié))，植深3～5 cm，第1天加入霍格藍一阿農營養(yǎng)液[10]600 mL，保證液面高于石英砂1～2 cm，每天用0.l mol/L HC1和0.1 mol/L NaOH調pH至5.8。每天觀察并及時補充營養(yǎng)液保持一致，待長出1～2片真葉及植株生長穩(wěn)定后，開始向營養(yǎng)液中一次加入CdCl2進行Cd脅迫處理。培養(yǎng)60 d后，選取植株部位、生長情況、葉齡一致具有代表性的葉片剪碎混勻用于抗氧化酶活性測定。剩余部分小心將魚腥草與石英砂分開，不破壞其生理結構，先用水將魚腥草沖洗干凈，再用去離子水完全沖洗干凈后用吸水紙拭干，并將魚腥草分地上部和地下部分別稱重后裝入信封袋。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性測定 取魚腥草新鮮葉片，用去離子水中沖洗干凈，濾紙拭干后進行抗氧化酶活性測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用240 nm 光密度比色法測定[17]。

1.3.2 相對葉綠素含量測定 采用SPAD-502葉綠素測定儀，選取部位、生長情況、葉齡一致具有代表性的葉片測定葉綠素相對含量，每盆5次重復，取平均值。

1.3.3 鮮質量測定 將各處理魚腥草從培養(yǎng)盆中挖出并清洗鮮凈，分為地下(根)和地上(莖、葉)兩部分，稱量各處理魚腥草鮮質量，計算魚腥草根冠比。

根冠比=地下部分鮮質量/地上部分鮮質量[18]。

1.4 基于主成分分析的不同生態(tài)型魚腥草抗Cd性綜合評價

以所測SOD、POD、CAT、SPAD 4個指標在Cd肋迫下的變化速率為基礎數據，利用主成分分析法綜合評價不同生態(tài)型魚腥草的抗Cd性。

1.5 數據處理

用Excel處理測定數據，用Origin 8.5.1作圖，用DPS軟件進行方差分析與多重比較。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫對不同生態(tài)型魚腥草生長的影響

由表1可知，與對照(CK)比較，隨著Cd脅迫的增加，3種生態(tài)型魚腥草地上部鮮重、地下部鮮重及生物量均呈下降趨勢，表明Cd污染可明顯抑制魚腥草的生長。不同產地中，烏當魚腥草在低濃度Cd污染脅迫下(0.25 mg/kg)，其地下部鮮重和生物量顯著降低，在Cd污染濃度為5 mg/kg時最低，與對照相比降低幅度分別達26.54%和33.19%；地上部鮮重則在Cd污染濃度高于1 mg/kg時降低量達顯著水平，在Cd濃度為5 mg/kg時，降幅為40.97%。平壩魚腥草在Cd低污染濃度脅迫下(0.25 mg/kg)，其地上部鮮重、地下部鮮重及生物量顯著的降低，并在Cd高濃度脅迫下(5 mg/kg)降低幅度最大，分別為38.85%、17.93%、29.12%。七星關產地，魚腥草地上部鮮重、地下部鮮重及生物量則在Cd污染濃度為1 mg/kg時，其降低量差異達顯著水平，且在Cd高污染濃度下(5 mg/kg)降低幅度最大，分別為38.15%、28.64%、33.13%。

表1 Cd脅迫下不同產地魚腥草的生長指標

根冠比是生物量累積分配的主要指標，其變化反映了植物地下部分與地上部分物質積累的變化情況。與對照比較，烏當魚腥草在低濃度Cd(0.25和0.5 mg/kg)脅迫下根冠比顯著降低，而在較高濃度Cd脅迫下(1和5 mg/kg)根冠比有一定程度升高，且達到顯著水平。平壩魚腥草在受到Cd脅迫時，其根冠比均表現(xiàn)出增大的趨勢，且差異性顯著。七星關產地魚腥草根冠比除Cd濃度為0.25和1 mg/kg時與對照比較差異不顯著外，其余處理的根冠比則顯著增加。

2.2 Cd脅迫對魚腥草抗氧化酶活性及葉綠素含量的影響

2.2.1 Cd脅迫對魚腥草SOD活性的影響 從圖1看出，隨著Cd脅迫濃度的升高，3種生態(tài)型魚腥草SOD均呈先升高后降低趨勢。烏當產地，不同Cd濃度魚腥草葉片的SOD活性顯著高于對照，說明Cd處理濃度范圍內對烏當產地的魚腥草毒害作用不明顯。平壩產地，與對照組比較，魚腥草葉片SOD活性在低Cd脅迫下有一定程度的升高，但差異性不顯著，在較高Cd濃度脅迫下(大于1 mg/kg)，其活性顯著低于對照，說明較高濃度Cd對該產地魚腥草的毒害作用較明顯。七星關產地，在Cd脅迫下，隨著處理濃度的增加SOD先上升后下降，在Cd處理濃度為5 mg/kg時顯著低于對照，說明高濃度Cd對該產地魚腥草的毒害作用明顯。

瀝青路面以其良好的行車舒適性、平整度、噪聲小等特點成為主要路面結構類型，隨著道路交通量增加迅速，車輛超載、重載現(xiàn)象嚴重，普通瀝青混凝土路面已難以滿足現(xiàn)有使用要求，因此有必要研究提高瀝青路面性能，延長其使用壽命。大量研究和實踐表明，SBS改性瀝青能夠明顯提高基質瀝青高低溫性能以及水穩(wěn)定性，相較于普通基質瀝青，在相同路面設計厚度下，SBS改性瀝青能夠顯著提高路面承載力，而在相同的路面設計壽命年限下，SBS改性瀝青路面鋪設厚度較低[1]，明顯減小施工用料，降低工程造價。本文結合工程實踐，探討工程用SBS改性瀝青制備方法，深入探討SBS改性瀝青混凝土路面施工技術。

不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05),下同Different lowercase letters indicate signficant difference at P<0.05 level,the same as below圖1 Cd脅迫下不同產地魚腥草的SOD活性Fig.1 SOD activity of Houttuynia casdata Thunbs with different origins under Cd stress

2.2.2 Cd脅迫對魚腥草POD活性的影響 由圖2可知，烏當產地魚腥草葉片的POD活性明顯高于平壩產地和七星關產地，七星關產地最低，且3個不同產地魚腥草受Cd影響的響應不同。隨Cd處理濃度的增加，烏當產地的POD活性先升高后降低，在Cd處理濃度為0.5 mg/kg時達最大，在Cd處理濃度為5 mg/kg時最小，且顯著低于對照。平壩產地隨Cd處理濃度的增加，魚腥草葉片POD活性總體呈下降趨勢，均顯著低于對照。七星關產地的魚腥草葉片POD隨Cd處理濃度的增加，其活性先升高后降低，在Cd處理濃度為1 mg/kg時達最大，不同處理后魚腥草葉片POD活性均顯著高于對照處理。

圖2 Cd脅迫下不同產地魚腥草的POD活性Fig.2 POD activity of Houttuynia casdata Thunbs with different origins under Cd stress

2.2.3 Cd脅迫對魚腥草CAT活性的影響 從圖3可知，3種生態(tài)型魚腥草葉片CAT活性隨著Cd脅迫濃度的增加均呈先升高再降低后又升高的趨勢。與對照相比，3種生態(tài)型魚腥草葉片CAT活性除在低濃度Cd(0.25 mg/kg)脅迫下差異不顯著外，其余處理均達顯著差異水平。烏當和平壩產地在Cd處理濃度為1 mg/kg時，CAT活性最低，且顯著低于對照，其他處理CAT活性均高于對照，尤其在Cd脅迫濃度為5.0 mg/kg時，CAT活性分比對照提高146.85%和68.72%。七星關產地則是在Cd處理濃度為0.5 mg/kg時，CAT活性降到最低，且顯著低于對照，在較高濃度Cd(大于1 mg/kg)脅迫下，其活性顯著增加，與對照比較增加幅度為355.95%～614.97%。

圖3 Cd脅迫下不同產地魚腥草的CAT活性Fig.3 CAT activity of Houttuynia casdata Thunbs with different origins under Cd stress

2.2.4 Cd脅迫對魚腥草相對葉綠素含量的影響 從圖4看出，3種生態(tài)型魚腥草受Cd污染脅迫后，其葉片SPAD值總體呈下降趨勢，且均低于對照。烏當產地不同處理均可降低魚腥草葉片SPAD含量，與對照比較達顯著差異水平，尤其在Cd處理濃度為5.0 mg/kg時，降幅高達52.20%。平壩產地魚腥草葉片SPAD值，除在低Cd處理濃度(0.25 mg/kg)無顯著差異外，其余處理SPAD含量均顯著降低，在Cd處理濃度為5.0 mg/kg時，降低幅度為14.56%。七星關產地魚腥草葉SPAD值在較低Cd濃度(<1 mg/kg)脅迫下降低不顯著，在高Cd濃度(2和5 mg/kg)處理下則顯著降低，并在Cd濃度為5.0 mg/kg時降低幅度最大，為27.57%?？梢?，高濃度Cd脅迫能明顯降低魚腥草葉片的SPAD值。

圖4 Cd脅迫下不同產地魚腥草的SPAD值Fig.4 SPAD value of Houttuynia casdata Thunbs with different origins under Cd stress

2.3 基于主成分分析的抗Cd性綜合評價

由表2可知，第一主成分(F1)的特征根為1.955，貢獻率為48.882%，第一主成分的貢獻率較大，其對應較大特征向量的評價指標有SOD、POD，這說明第一主成分的貢獻率主要來自SOD、POD這2個指標。第二主成分(F2)特征值為1.261，貢獻率為31.534%，相關性較大的特征向量評價指標為CAT、SPAD。利用各指標的方差除以主成分的方差得各指標分別在第一主成分和第二主成分上的權重，兩主成分的貢獻率進行歸一化處理得第一主成分的權重為0.608，第二主成分的權重為0.392。設抗氧化酶綜合評價指數為Z，則每種生態(tài)型魚腥草抗Cd抗氧化酶綜合評價指數為Z=0.608F1+0.392F2。

表2 主成分的貢獻率和各生理指標的特征向量和權重

采取脅迫最高濃度(5.0 mg/kg)計算出抗氧化酶綜合評價系數來表征3種生態(tài)型魚腥草抗Cd情況，從表3看出，在烏當產地魚腥草的抗Cd脅迫能力最強，其抗Cd脅迫綜合評價系數為2.310；烏當產地最強，平壩產地魚腥草的抗Cd脅迫能力最小，抗Cd脅迫綜合評價系數為-0.167；七星關產地魚腥草的抗Cd脅迫能力居中，抗氧化酶綜合評價系數為0.258。3種生態(tài)型魚腥草抗氧化酶綜合指數排序為烏當產地>七星關產地>平壩產地。

表3 不同產地魚腥草抗氧化酶綜合評價值及排序

3 討 論

Cd是植物非必須元素，其進入植物并積累到一定程度，就會表現(xiàn)出毒害癥狀，通常會出現(xiàn)生長遲緩、植株矮小、退綠、鮮物質累積量下降等癥狀[6]。本研究表明，Cd脅迫處理顯著影響3種生態(tài)型魚腥草生長。當Cd脅迫濃度高于5.0 mg/kg時，3種生態(tài)型魚腥草地上部鮮重、地下部鮮重和生物量均顯著降低且降至最低值，這與吳濤等[11]研究結果相似，原因可能是Cd通過植物根部吸收進入植物體內后，通過區(qū)域化分布貯存于葉綠體中，破壞葉綠體酶系統(tǒng)和阻礙葉綠體合成，Cd也會抑制線粒體膜上ATP酶的活性引起線粒體結構的改變，進而損失了植物的光合作用[19]。其中，3種生態(tài)型魚腥草鮮重受Cd脅迫而導致鮮重降低的脅迫濃度不盡相同，說明不同產地魚腥草對Cd的抗性能力有所不同。植物受到環(huán)境脅迫時會調節(jié)其根冠比來適應環(huán)境的變化[20]。本研究得出3種生態(tài)型魚腥草受Cd脅迫后其根冠比總體呈升高趨勢，可能是由于魚腥草在受到環(huán)境脅迫時，通過增加根冠比來提高對外界逆境的生存能力。

重金屬脅迫會引起植物內部活性氧的累積，導致根系組織內的氧化脅迫和膜損傷，影響抗氧化酶系的活性，從而抑制植物的生長[7]。與此同時，植物內部也存在由POD、SOD和CAT組成的抗氧化酶系統(tǒng)，可以有效地清除體內因環(huán)境脅迫而產生的活性氧自由基，使細胞免受活性氧的損害，提高植物的抗逆能力，抵抗逆境的能力因不同植物，不同組織部位而不同[21]。本研究結果表明，3種生態(tài)型魚腥草抗氧化酶SOD活性隨著Cd脅迫濃度升高呈先升高后降低趨勢。烏當產地魚腥草受到Cd脅迫后，魚腥草葉片的SOD活性均高于空白對照，增幅最高達72.14%。平壩與七星關產地魚腥草受Cd脅迫處理后，葉片SOD活性在低濃度時有所增加，可能是由于ROS水平的提高而引起的適應性反應，但隨著脅迫濃度增大，植物體內ROS水平超負荷抑制SOD活性[22],從而導致SOD活性逐漸降低且低于空白對照。

POD是植物體內活性氧防御系統(tǒng)的酶系成分之一，能有效清除逆境條件下細胞中產生的自由基，在抗逆境脅迫中起著關鍵作用，其活性變化，既可表示逆境脅迫的強弱，也可反映植物自身的抗逆潛力，其能將植物體內的H2O2分解為H2O和O2，減輕植物因環(huán)境脅迫而產生的損傷[23]。試驗表明，烏當和七星關產地的魚腥草POD活性隨著Cd濃度增高表現(xiàn)出先增高后減低的趨勢。原因可能是POD在受到Cd脅迫初期活性上升，是抗氧化系統(tǒng)對Cd脅迫的適應性反應，隨著Cd脅迫程度的加深，酶活性受到抑制，趨于下降[24]。七星關產地魚腥草的POD活性在1.0 mg/kg時達到最大值，比空白CK增加133.14%，且全部脅迫處理后，葉片POD的活性均高于CK，表現(xiàn)出相同耐性基礎。Cd脅迫時平壩產地的魚腥草POD活性下降53.44%，差異顯著說明受Cd脅迫后魚腥草體內產生的自由基已經影響到了POD的活性，這一結果與李錚錚等[10]的研究結果不同，可能是因為植物由于不同重金屬脅迫產生的不同誘導機制[25]。

CAT是一種對H2O2具有強有力清除能力的抗氧化酶，CAT活性的增高可以體現(xiàn)植物內部H2O2水平提高。本研究中，3種生態(tài)型魚腥草葉片CAT活性均隨著Cd脅迫濃度的增加呈先升高再降低后又升高的趨勢，原因可能是受Cd脅迫時，CAT增加以補充降低的POD，從而消除Cd脅迫產生的H2O2，降低魚腥草因Cd脅迫而產生的損傷。亓琳等[17]研究發(fā)現(xiàn)，燕麥受鍶脅迫時，CAT活性也會提高且均高于CK。由此推測，魚腥草在受Cd脅迫時，SOD、CAT可能在清除過氧化產物時發(fā)揮關鍵作用。

葉綠素是植物能否進行光合作用的主要色素，其含量高低甚至影響植物正常的新陳代謝[26]。植物葉綠素含量的變化，不但可反映出植物葉片光合功能的強弱，而且可表征逆境脅迫下植物組織、器官的衰老狀況[27]。由SPAD-502葉綠素含量測定儀獲取的SPAD值能較精確地擬合葉綠素含量值，能夠代替葉綠素含量值[28-29]。賴秋雨等[30]研究表明，番茄受到濃度大于8 mg/kg Cd脅迫時，葉片中的葉綠素含量會顯著低于CK，這與本研究結果相似，即3種生態(tài)型魚腥草受Cd脅迫后，葉片SPAD值總體呈下降趨勢，5.0 mg/kg處理下顯著低于對照14.56%～52.20%。葉綠素含量的降低影響了植物光合作用，從而也導致魚腥草鮮物質累積量降低。

3種生態(tài)型魚腥草抗氧化酶綜合系數排序為烏當產地>七星關產地>平壩產地，表明3種生態(tài)型魚腥草受到Cd脅迫時其抗氧化酶活性的大小變化情況。植物受到環(huán)境脅迫時，通過維持或提升體內抗氧化酶活性來增加其抗逆性[31-32]。因此，推測3種生態(tài)型魚腥草抗Cd脅迫指數大小應該與抗氧化酶綜合指數排序呈相反趨勢，即平壩產地>七星關產地>烏當產地。該結果從Cd脅迫處理后魚腥草的表觀形態(tài)得到證實，輕度脅迫時，3種生態(tài)型魚腥草與對照差異不大，當脅迫高于5.0 mg/kg時，烏當產地魚腥草明顯出現(xiàn)葉片發(fā)黃，植株矮小等特征，而七星關產地情況則好于烏當產地，平壩產地魚腥草葉片基本沒有發(fā)生變化，生物量也是高于其他產地。魚腥草在Cd脅迫下的表觀形態(tài)變化，可作為判斷魚腥草對Cd抗逆性的直觀指標，只有綜合生理指標的綜合評價，才能更好地反映植物抗逆性。

4 結 論

Cd脅迫處理顯著影響魚腥草生長，當Cd濃度高于5.0 mg/kg時，3種生態(tài)型魚腥草地上部、地下部鮮重、生物量及葉片葉綠素含量與CK相比顯著降低?？寡趸富钚詣t呈低濃度Cd提高SOD、POD活性，高濃度則抑制其活性，CAT的活性大體隨處理濃度加深而升高趨勢。其中，SOD和CAT可能在魚腥草受Cd脅迫時起關鍵作用。相對葉綠素含量隨Cd脅迫加深而降低，烏當產地降低幅度高達52.20%。3種生態(tài)型魚腥草抗Cd脅迫指數大小為平壩產地>七星關產地>烏當產地。