基于GC-MS的不同產(chǎn)地鐵皮石斛代謝物差異分析

李紫曦，牟美睿，楊仁杰，劉海學(xué)

(1. 天津農(nóng)學(xué)院園林園藝學(xué)院，天津 300384；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；3. 天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384；4. 天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384)

【研究意義】石斛的來(lái)源和品種確定是用藥過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，明確鐵皮石斛來(lái)源對(duì)保證鐵皮石斛用藥準(zhǔn)確性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet Migo)屬蘭科多年生草本植物，因其含有多種生物堿、多糖、酮類(lèi)等成分[1]具有控制糖尿病和抗腫瘤等功效，是一種藥用價(jià)值極高的傳統(tǒng)中藥材。鐵皮石斛繁殖能力較低，在自然條件下發(fā)芽率不足5%，野生資源較少，因而市售大部分為栽培品[2]，但藥用功效及質(zhì)量高低不一，《中國(guó)藥典》2015版[3]明確指出，不同來(lái)源的鐵皮石斛性質(zhì)及藥效具有較大差異，同時(shí)生長(zhǎng)環(huán)境可以顯著改變鐵皮石斛體內(nèi)的代謝成分[4]，有研究表明不同的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)鐵皮石斛的有效成分會(huì)產(chǎn)生影響，而野外環(huán)境則更利于積累有效性較高的次生代謝物[5-6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)(GC-MS)對(duì)6份來(lái)自不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，同時(shí)結(jié)合主成分分析、偏最小二乘判別分析、聚類(lèi)分析等多元統(tǒng)計(jì)分析方法查找標(biāo)志性差異代謝物，構(gòu)建石斛代謝組學(xué)的產(chǎn)地鑒定方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為確定鐵皮石斛植源性鑒定的考量指標(biāo)提供參考，同時(shí)為鐵皮石斛質(zhì)量控制提供理論向?qū)Ш图夹g(shù)支持[7]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測(cè)試中心保存的鐵皮石斛樣品，分別為來(lái)自貴州銅仁市沿河縣(11號(hào))、廣東韶關(guān)仁化縣(21號(hào))、浙江溫州雁蕩山鎮(zhèn)(31號(hào))、云南普洱思茅鎮(zhèn)(41號(hào))、湖南郴州資興市(51號(hào))的野生石斛品種和來(lái)自湖南的室內(nèi)栽培石斛品種(61號(hào))。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 METTLER TOLEDO AL204電子天平；新芝SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)；Eppendorf Centrifuge 5920R冷凍離心機(jī)；凱航HH-2恒溫水浴鍋；?？芌eeko-Auto EVA全自動(dòng)氮吹濃縮儀；Aglient 7890A-5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；Aglient HP-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.2.2 藥品與試劑 乙腈、異丙醇、吡啶、正庚烷，純度均為色譜純；鹽酸甲氧胺、N-甲基N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.9%；超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制 參考張麗增等[8]方法，分別取6份試驗(yàn)材料長(zhǎng)勢(shì)相同的鐵皮石斛成苗功能葉，液氮研磨至粉末，稱(chēng)取150 mg加入體積比為1∶1∶1的乙腈—異丙醇—水混合溶液，超聲提取35 min(40 KHZ，4 ℃)后10 000 r/min離心1 min，取上清液100 μL氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.3.2 GC-MS分析條件 色譜條件：升溫程序?yàn)槌厣?100 ℃，色在 100 ℃下保持1 min，然后以10 ℃/min的速度升至280 ℃，保持 8 min，載氣為純度 99.999%的氦氣，流量為 1.0 mL/min進(jìn)樣模式不分流，進(jìn)樣量1 μL。離子源和進(jìn)樣口溫度分別保持在230和250 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲4.5 min；質(zhì)譜條件：EI能量-70 eV；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度-150 ℃；溶劑延遲4.5 min；掃描范圍-50～500 m/z；掃描速度2 scan/s。

1.3.3 衍生化處理 待有機(jī)試劑揮發(fā)盡后，進(jìn)行衍生化處理，取10 μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液(40 mg/mL)加入樣品中置于30 ℃恒溫90 min后，向樣品中加入30 μL衍生劑(MSTFA+1%TMCS)置于37 ℃恒溫30 min，最后加入1 mL溶劑正庚烷(含20 μg/mL內(nèi)標(biāo)物十一烷)過(guò)0.22 μm微膜，轉(zhuǎn)入GC進(jìn)樣瓶待上機(jī)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)GC-MS光譜全波段掃描石斛葉片代謝物質(zhì)，Agilent-MassHunter工作站對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取，最后得到保留時(shí)間(rt)及峰面積(intensity)，利用Origin 7.5繪制總離子流圖；導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Microsoft Excel 2016整理，并利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)進(jìn)行定性定量分析，通過(guò)SIMCA-P 13.0進(jìn)行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法—判別分析(PLS-DA)，使用 SPSS 23.0進(jìn)行t檢驗(yàn)(Student’st-test)，利用Omicshare平臺(tái)進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析(HCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物GC-MS分析

對(duì)不同產(chǎn)地鐵皮石斛進(jìn)行GC-MS分析，通過(guò)總離子流圖(圖1)可以看出，6份石斛材料中共掃描出116個(gè)峰，出峰時(shí)間集中于12～20 min，但峰高及出峰時(shí)間存在品種間差異，經(jīng)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋后，6份石斛材料中共得到71個(gè)代謝物，如表1所示，包括20種有機(jī)酸、11種氨基酸、20種糖及衍生物和20種化合物。其中由于鐵皮石斛均屬蘭科植物，存在共有代謝物10種，如蘋(píng)果酸、天冬氨酸、半乳糖等。除此之外，不同產(chǎn)地的石斛代謝物之間存在明顯差異，其不同主要表現(xiàn)在糖類(lèi)與有機(jī)酸上。糖類(lèi)作為植物光合作用產(chǎn)生的單糖經(jīng)特定酶催化后形成的化合物[9]，可以看出由于環(huán)境的不同會(huì)造成石斛體內(nèi)代謝物的差異，因此可根據(jù)代謝物差異對(duì)石斛產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分。

圖1 不同產(chǎn)地鐵皮石斛GC-MS分析總離子流Fig.1 GC-MS analysis of total ion chromatogram of Dendrobium nobile from different productions

表1 不同產(chǎn)地鐵皮石斛GC-MS鑒定結(jié)果

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛差異代謝物鑒定

2.2.1 PCA分析 為清晰得出不同產(chǎn)地鐵皮石斛之間的代謝物差異，首先利用主成分分析(PCA)的方法對(duì)不同產(chǎn)地石斛代謝物進(jìn)行降維分析，得到二維與三維得分圖(圖2 a～b)進(jìn)而判別栽培品種鐵皮石斛與野生品種鐵皮石斛之間的差異。通過(guò)PCA分析可以得知，不同產(chǎn)地鐵皮石斛代謝物間存在顯著差異，第1主成分(t1)可以將栽培品種與貴州、廣東野生品種區(qū)分開(kāi)，第2主成分(t2)可以將栽培品種與浙江、溫州野生品種區(qū)分開(kāi)，但不能將湖南品種與栽培品種區(qū)分開(kāi)，由于主成分分析僅能較好的反映原始數(shù)據(jù)，無(wú)法忽略組間差異，因此后續(xù)將采用有監(jiān)督的分析方法對(duì)湖南品種與栽培品種進(jìn)行區(qū)分。

圖2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛PCA二維(a)和三維得分圖(b)Fig.2 Two-dimensional (a) and three-dimensional scores (b) of PCA of Dendrobium from different products

2.2.2 PLS-DA分析 為進(jìn)一步鑒別野生石斛與栽培石斛之間的差異代謝物，對(duì)代謝物含量歸一化處理后進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)得到PLS-DA得分圖(圖3-a)，R2=0.984，Q2=0.997，同時(shí)為防止模型過(guò)擬合進(jìn)行交叉驗(yàn)證后所有點(diǎn)均小于原始R2，說(shuō)明模型擬合較好且具有可行性。通過(guò)得分圖我們可以看出，有監(jiān)督的分析方法能較好的將湖南野生石斛品種與栽培品種區(qū)分開(kāi)，進(jìn)而得出投影變量權(quán)重值(VIP)，圖中柱子高度與對(duì)模型貢獻(xiàn)值越高(圖3-b)，差異越顯著[10]。

圖3 不同產(chǎn)地鐵皮石斛PLS-DA得分圖(a)和VIP圖(b)Fig.3 PLS-DA score map of Dendrobium of different production lines (a) and VIP map (b)

2.2.3 差異代謝物鑒定 結(jié)合PLS-DA分析得出的VIP圖，再利用SPSS對(duì)篩選出的差異代謝物進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)合2種方法(VIP>1，P<0.05)篩選出兩地石斛的差異代謝物20種，分別為6種有機(jī)酸、6種糖類(lèi)、3種氨基酸及5種化合物(圖4-a)，其中9種代謝物為湖南野生品種特有，包括3種有機(jī)酸(丁酸、丁烯酸、乙酰乙酸)、3種氨基酸(絲氨酸、甘氨酸、天冬酰胺)、2種糖及衍生物(葡糖醛糖、木糖)和1種化合物(芐醇)，而11種代謝物為室內(nèi)盆栽品種特有，包括3種有機(jī)酸(丙酸、十六烷酸、丁二酸)、4種糖及衍生物(阿拉伯糖、核糖、果糖、塔洛糖)、1種氨基酸(蘇氨酸)及3種化合物(二醇、抗壞血酸、苯丙醇胺)，對(duì)差異代謝物以差異倍數(shù)繪制火山圖(圖4-b)，20種差異代謝物分散在左右兩側(cè)，差異顯著。

圖4 湖南野生與室內(nèi)栽培鐵皮石斛差異代謝物(a)與差異代謝物火山圖(b)Fig.4 Different metabolites (a) and differential metabolites of Hunan wild and indoor cultivated Dendrobium candidum (b)

圖5 差異代謝物聚類(lèi)分析熱圖Fig.5 Cluster analysis heatmap of differential metabolites

2.3 差異代謝物聚類(lèi)熱圖分析

利用Omicshare 平臺(tái)根據(jù)差異代謝物鑒定篩選出的差異代謝物對(duì)不同產(chǎn)地鐵皮石斛進(jìn)行代謝物和品種兩個(gè)維度的聚類(lèi)熱圖分析(HCA)，如圖5所示，樹(shù)形熱圖中橫坐標(biāo)代表不同產(chǎn)地鐵皮石斛品種，縱坐標(biāo)代表差異代謝物，其中紅色表達(dá)代謝物顯著上調(diào)，響應(yīng)藍(lán)色代表顯著下調(diào)，通過(guò)圖中我們可以看出，6號(hào)室內(nèi)栽培品種中蘇氨酸顯著上調(diào)，區(qū)別與其他品種，而丙酸顯著下調(diào)區(qū)別于其他品種，同時(shí)根據(jù)聚類(lèi)熱圖分析可以看出，20種差異代謝物可以很好的將野生石斛品種與室內(nèi)栽培品種區(qū)分開(kāi)。

3 討 論

鐵皮石斛含有多種化學(xué)成分，主要包括多糖、黃酮、生物堿、氨基酸等，也是鐵皮石斛發(fā)揮藥理活性的物基礎(chǔ)[11]。本試驗(yàn)基于氣質(zhì)聯(lián)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)6份不同產(chǎn)地的鐵皮石斛成苗代謝物進(jìn)行野生種于栽培種的差異分析，找到包括丙酸、蘇氨酸等在內(nèi)的20種顯著差異代謝物，大多為糖類(lèi)(葡糖醛糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、果糖、塔洛糖)、酸類(lèi)(丁酸、丁烯酸、乙酰乙酸、丙酸、十六烷酸、丁二酸)，其次為氨基酸類(lèi)(蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸)和化合物類(lèi)(芐醇、天冬酰胺、二醇、抗壞血酸、苯丙醇胺)。有研究表明，糖類(lèi)、氨基酸和有機(jī)酸含量的增加能提高植物的抗逆性[12-13]。劉建兵[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，馬尾松苗木在干旱脅迫下，體內(nèi)脯氨酸及游離氨基酸含量顯著增加，同時(shí)高榮嶸等[15]在研究花生幼苗受到鹽脅迫后發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸的含量也表現(xiàn)出顯著上升，包雨卓[16]在分析冬小麥在低溫脅迫下的代謝物質(zhì)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分糖類(lèi)、氨基酸和有機(jī)酸顯著增加，說(shuō)明了冬小麥通過(guò)大部分糖類(lèi)、氨基酸和有機(jī)酸的增加來(lái)抵御低溫的脅迫。多種植物在對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)的過(guò)程中都表現(xiàn)出糖類(lèi)、有機(jī)酸等物質(zhì)顯著增加的現(xiàn)象，而多糖也是鐵皮石斛花中的主要活性組分[17]，在本研究中通過(guò)對(duì)比野生石斛與室內(nèi)栽培石斛品種差異代謝物的種類(lèi)與含量，反映野生種與栽培種石斛差異代謝物也主要體現(xiàn)在糖類(lèi)、氨基酸及有機(jī)酸類(lèi)，這可能是由于栽培品種石斛為了適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境從而使體內(nèi)代謝水平發(fā)生變化。

本研究以不同產(chǎn)地鐵皮石斛為材料進(jìn)行差異代謝物分析得出，野生品種石斛與栽培品種石斛在代謝物種類(lèi)及含量水平上存在顯著差異，通過(guò)分析比較不同產(chǎn)地間鐵皮石斛小分子代謝物從而得出20種主要差異代謝物，從而達(dá)到鑒定不同產(chǎn)地鐵皮石斛的目的，為鐵皮石斛種質(zhì)鑒定研究提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

(1)經(jīng)GC-MS分析后，6份石斛材料中共得到71個(gè)代謝物，包括20種有機(jī)酸、11種氨基酸、20種糖及衍生物和20種化合物。其中存在共有代謝物10種，如蘋(píng)果酸、天冬氨酸、半乳糖等。

(2)經(jīng)PLS-DA分析后得出，主要差異代謝物分別為6種有機(jī)酸、6種糖類(lèi)、3種氨基酸及5種化合物，其中9種代謝物為湖南野生品種特有，11種代謝物為室內(nèi)盆栽品種特有。

(3)對(duì)差異代謝物利用聚類(lèi)分析，根據(jù)聚類(lèi)熱圖分析可以看出，20種差異代謝物可以很好的將野生石斛品種與室內(nèi)栽培品種區(qū)分開(kāi)，此方法具有可行性。