紫金龍營(yíng)養(yǎng)器官組織結(jié)構(gòu)和組織化學(xué)定位研究

朱新焰，楊維澤，楊紹兵，曩興麗，楊竹雅，季鵬章，張金渝

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，昆明 650223；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500)

【研究意義】紫金龍[Dactylicapnosscandens(D.Don) Hutch.]是罌粟科 (Papaveraceae)紫金龍屬多年生藤本植物，藥用其根，主產(chǎn)于中國(guó)云南、四川、廣西和西藏等西南省區(qū)[1]。具有鎮(zhèn)痛、止血、消炎等功效，主要用于治療牙痛、外傷腫痛、胃痛等各類(lèi)疼痛及血崩、內(nèi)傷出血、跌打損傷等病癥[2-3]。紫金龍是中國(guó)民族民間傳統(tǒng)藥材，藥用歷史悠久，功效確切。由于用量較大，野生資源采挖嚴(yán)重，藥材常有參偽現(xiàn)象[4-5]。因此，有必要對(duì)紫金龍的藥用部位及莖、葉等器官進(jìn)行研究，探索各器官化學(xué)成分的種類(lèi)及分布量，為資源開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。[6-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對(duì)紫金龍的研究主要在資源調(diào)查、栽培技術(shù)及根的化學(xué)成分研究等方面[8-11]，對(duì)紫金龍營(yíng)養(yǎng)器官組織結(jié)構(gòu)及組織化學(xué)定位的系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】目前，紫金龍以根入藥，莖、葉等非藥用部位常遭廢棄，對(duì)資源造成了比較嚴(yán)重的浪費(fèi)。利用組織顯微及化學(xué)定位方法，從而分析紫金龍各營(yíng)養(yǎng)器官的顯微組織結(jié)構(gòu)和黃酮、多糖、生物堿及皂苷等成分在不同器官的各組織中的儲(chǔ)存與分布特征，從而充分利用資源，減少相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的流失[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】揭示紫金龍不同器官的顯微構(gòu)造特征和主要化學(xué)物質(zhì)的分布積累特征，為紫金龍資源的保護(hù)和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)[13]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫金龍樣品采自保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院滇中藥用植物資源圃，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)楊竹雅副教授鑒定為紫金龍[Dactylicapnosscandens(D.Don) Hutch.]，樣品標(biāo)本均保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物標(biāo)本室。

試劑：乙醇、品紅、香草醛、冰醋酸、高氯酸、亞硫酸氫鈉、偏重亞硫酸鈉、高碘酸、氫氧化鈉、堿式硝酸鉍、碘化鉀等試劑均為分析純，水為純化水。

儀器：HS-2026型生物組織切片機(jī)；KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；TGL-16M離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)；AR124CN電子分析天平(奧豪斯上海有限公司)；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；Nikon 80i型顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 器官顯微構(gòu)造 各營(yíng)養(yǎng)器官樣品均采自相同生長(zhǎng)年限的紫金龍植株，先用FAA液將各器官組織進(jìn)行固定，再用乙醇梯度脫水，將各器官分別進(jìn)行徒手切片和石蠟制片，各切片厚度約為12～30 μm，制片后分別在不同顯微鏡倍數(shù)下觀察并拍照記錄[14-15]。

1.2.2 組織化學(xué)染色及定位 制片：分別對(duì)紫金龍的3個(gè)營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行切片、制片，各器官樣品分別選取10～15張組織結(jié)構(gòu)完整、無(wú)碎片及細(xì)胞清晰的切片分別進(jìn)行黃酮、生物堿、多糖及皂苷等物質(zhì)的染色和定位后，于不同倍數(shù)顯微鏡下觀察并分析結(jié)果。

顯色反應(yīng)及物質(zhì)定位：依據(jù)黃酮、生物堿、多糖及皂苷類(lèi)物質(zhì)的特征顯色反應(yīng)，分別以5%NaOH水溶液、改良碘化鉍鉀試劑、高碘酸—希夫試劑及等量的5%香草醛—冰醋酸和高氯酸試劑對(duì)黃酮、生物堿、多糖及皂苷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行顯色和定位。4種物質(zhì)與上述相應(yīng)顯色試劑反應(yīng)后分別顯黃色、橙黃色或橙紅色、紅色至紫紅色、粉紅色至紅色[16-17]。

1.2.3 顯微觀察方法及數(shù)據(jù)分析 選取紫金龍根、莖、葉3種營(yíng)養(yǎng)器官的10張顯色切片，對(duì)各切片的不同組織區(qū)域、細(xì)胞進(jìn)行觀察，各區(qū)域均選取6個(gè)不同視野；并使相同倍數(shù)的觀察面積相等，統(tǒng)計(jì)不同組織各視野中的染色顆粒狀物質(zhì)的數(shù)量，取平均值。根據(jù)組織中著色顆粒物質(zhì)的數(shù)量和密度等，依次劃為6個(gè)等級(jí)，其中“/”為未見(jiàn)顯色，顯色程度從低到高分別用1～5個(gè)“+”表示[18-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫金龍根的組織構(gòu)造及組織化學(xué)定位

2.1.1 顯微構(gòu)造特征 木栓層為2～4列(圖1-A)，類(lèi)長(zhǎng)方形或不規(guī)則形，有的細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕色物質(zhì)。皮層較寬，薄壁組織中可見(jiàn)含黃色揮發(fā)油的乳汁管，薄壁細(xì)胞內(nèi)含淀粉粒。形成層環(huán)較明顯。射線貫穿木質(zhì)部及韌皮部。木質(zhì)部可見(jiàn)木纖維，導(dǎo)管直徑約26～140 μm。薄壁細(xì)胞內(nèi)有大量淀粉粒，直徑約5～37 μm，臍點(diǎn)類(lèi)型多樣，復(fù)粒多由2～4分粒組成。

2.1.2 物質(zhì)定位及分布積累特征 黃酮：皮層薄壁細(xì)胞及木質(zhì)部組織細(xì)胞顯色較深(表1，圖1-B)，乳汁管及韌皮部組織中黃色較淺，黃酮類(lèi)成分分布較少。各組織黃酮分布量為皮層>木質(zhì)部>韌皮部。

表1 紫金龍根的組織中4種化學(xué)成分分布多度

生物堿：大量皮層薄壁組織和韌皮部組織細(xì)胞顯橙黃色(圖1-C)，分布有極多的生物堿類(lèi)成分，而木質(zhì)部及其它組織細(xì)胞則染色較淺。各組織生物堿分布數(shù)量為皮層>韌皮部>木質(zhì)部。

多糖：皮層及木質(zhì)部組織多顯紫紅色(圖1-D)，多糖大量?jī)?chǔ)藏在皮層及木質(zhì)部組織中，韌皮部可見(jiàn)紅色顆粒及團(tuán)塊，木栓層有少量分布，各組織多糖分布數(shù)量為皮層>木質(zhì)部>韌皮部。

皂苷：皂苷較多分布在皮層組織中(圖1-E)，其次為韌皮部組織細(xì)胞，2種組織均多顯紅色，木栓層及木質(zhì)部有少量分布。各組織皂苷分布數(shù)量為皮層>韌皮部>木質(zhì)部。

A：根的組織結(jié)構(gòu)圖；B：根中黃酮分布;C:根中生物堿分布;D:根中多糖分布;E: 根中皂苷分布。a：皮層(40×)；b：維管束(40×)；Pa：基本薄壁組織；Co：皮層；Vb：維管束；Ph：韌皮部；Xy：木質(zhì)部；Fl：黃酮；Al：生物堿；Po：多糖；Sa：皂苷A: Tissue structure of roots; B: Distribution of flavonoids in roots; C: Distribution of alkaloids in roots; D: Distribution of polysaccharides in roots; E: Distribution of saponins in roots.a: The cortex (40×); b:The vascular bundles (40×); Pa: Parenchyma; Co: Cortex; Vb: Vascular bundle; Ph: Phloem; Xy: Xylem; Fl: Flavone; Al: Alkaloid; Po: Polysaccharide; Sa: Saponin圖1 紫金龍根的組織構(gòu)造及組織化學(xué)定位Fig.1 Tissue structure and histochemical localization in roots of Dactylicapnos scandens

2.2 紫金龍莖的組織構(gòu)造及組織化學(xué)定位

2.2.1 顯微構(gòu)造特征 表皮細(xì)胞1～2列(圖2-A)，類(lèi)長(zhǎng)方形、類(lèi)正方形、外壁光滑。皮層細(xì)胞多呈不規(guī)則多邊形或類(lèi)圓形，細(xì)胞間隙明顯。表皮內(nèi)側(cè)可見(jiàn)1列含葉綠體的類(lèi)圓形或不規(guī)則形薄壁細(xì)胞。維管束外韌型、環(huán)狀排列。乳汁管散在于皮層及韌皮部的薄壁組織中，內(nèi)含黃色乳汁狀分泌物。木質(zhì)部導(dǎo)管多為徑向排列，偶散在，直徑約4.3～35 μm。木纖維多成群分布，直徑約1.8～4.6 μm。髓部較寬，多中空。

2.2.2 物質(zhì)定位及分布積累特征 黃酮：部分皮層薄壁組織及韌皮部組織細(xì)胞顯黃色(圖2-B)，這2種組織是黃酮類(lèi)成分的主要分布場(chǎng)所，表皮、乳汁管及木質(zhì)部細(xì)胞可見(jiàn)少量分布。各組織黃酮分布數(shù)量為皮層>韌皮部>木質(zhì)部(表2)。

表2 紫金龍莖的組織中4種化學(xué)成分分布多度

生物堿：生物堿大量分布在皮層組織中，染色多呈橙黃色顆粒狀或團(tuán)塊狀(圖2-C)。韌皮部及木質(zhì)部組織細(xì)胞及細(xì)胞間隙染色多呈橙紅色或橙色，表皮細(xì)胞則少數(shù)染色。各組織生物堿分布數(shù)量為皮層>韌皮部>木質(zhì)部。

多糖：多糖在整個(gè)組織均有分布，以皮層組織細(xì)胞染色最深(圖2-D)，韌皮部及木質(zhì)部組織細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞壁多數(shù)顯紅色或紫色。表皮細(xì)胞亦有分布。各組織多糖分布數(shù)量為皮層>韌皮部≥木質(zhì)部。

A：莖的組織結(jié)構(gòu)；B：莖中黃酮分布；C：莖中生物堿分布；D：莖中多糖分布；E：莖中皂苷分布。a：皮層(40×)；b：維管束(40×)；Ep：表皮；Pa：基本薄壁組織；Co：皮層；Vb：維管束；Ph：韌皮部；Xy：木質(zhì)部；Fl：黃酮；Al：生物堿；Po：多糖；Sa：皂苷A : Tissue structure of stem; B: Distribution of flavonoids in stems; C: Distribution of alkaloids in stems; D: Distribution of polysaccharides in stems; E: Distribution of saponins in stems.a: The cortex (40×); b:The vascular bundles (40×); Ep: Epidermis; Pa: Parenchyma; Co: Cortex; Vb: Vascular bundle; Ph: Phloem; Xy: Xylem; Fl: Flavone; Al: Alkaloid; Po: Polysaccharide; Sa: Saponin圖2 紫金龍莖的組織構(gòu)造及組織化學(xué)定位Fig.2 Tissue structure and histochemical localization in stems of Dactylicapnos scandens

皂苷：靠近表皮的2～3層皮層細(xì)胞顯紫紅色(圖2-E)，顯示該區(qū)域有大量皂苷分布，韌皮部及木質(zhì)部組織細(xì)胞中亦有一定量分布，表皮細(xì)胞可見(jiàn)少量分布。各組織皂苷分布數(shù)量為皮層>韌皮部>木質(zhì)部。

2.3 紫金龍葉的組織構(gòu)造及組織化學(xué)定位

2.3.1 顯微構(gòu)造特征 兩面葉表皮均外被角質(zhì)層；表皮細(xì)胞長(zhǎng)圓形或近長(zhǎng)方形(圖3-A)。主脈處的表皮細(xì)胞壁均略增厚；此處上、下表皮內(nèi)側(cè)均分布1～2層厚角組織細(xì)胞。海綿組織可見(jiàn)，柵欄組織細(xì)胞排列緊密。主脈維管束為外韌型，木質(zhì)部導(dǎo)管徑向排列，射線明顯。側(cè)脈維管束外被1層薄壁鞘細(xì)胞。偶見(jiàn)細(xì)小草酸鈣結(jié)晶散在于表皮、葉脈及葉肉薄壁組織細(xì)胞中。

2.3.2 物質(zhì)定位及分布積累特征 黃酮：葉片黃酮儲(chǔ)存量較少(表3，圖3-A)，主要在葉肉薄壁細(xì)胞中，木質(zhì)部組織顯黃色。表皮及韌皮部分布則極少。葉片各組織黃酮分布數(shù)量依次為為葉肉>維管束>表皮(因葉片維管組織不甚發(fā)達(dá)，所以將韌皮部、木質(zhì)部等相關(guān)組織進(jìn)行綜合分析，不再細(xì)分，后同)。

表3 紫金龍葉的組織中4種化學(xué)成分分布多度

生物堿：在葉肉細(xì)胞中多數(shù)呈橙黃色滴狀、顆粒狀或團(tuán)塊狀(圖3-B)。木質(zhì)部組織細(xì)胞則多呈橙紅色。韌皮部及表皮組織染色極淺或未見(jiàn)染色。各組織生物堿分布數(shù)量為葉肉>維管束>表皮。

多糖：葉肉細(xì)胞中多糖多呈紫色、紫紅色顆粒狀(圖3-D)，維管束組織則多顯紅色。表皮細(xì)胞顯色較淺。葉片除上下表皮分布外，多糖在維管束及葉肉組織細(xì)胞中分布極多，各組織多糖分布數(shù)量為葉肉>維管束>表皮。

A：葉的組織結(jié)構(gòu)；B：葉中黃酮分布；C：葉中生物堿分布；D：葉中多糖分布；E：葉中皂苷分布。a：皮層(40×)；b：維管束(40×)；Ep：表皮；Pa：基本薄壁組織；Co：皮層；Vb：維管束；Ph：韌皮部；Xy：木質(zhì)部；Me：葉肉細(xì)胞；Fl: 黃酮；Al：生物堿；Po：多糖；Sa：皂苷A: Tissue structure of leaves; B: Distribution of flavonoids in leaves; C: Distribution of alkaloids in leaves; D: Distribution of polysaccharides in leaves; E: Distribution of saponins in leaves.a: The cortex (40×); b:The vascular bundles (40×); Ep: Epidermis; Pa: Parenchyma; Co: Cortex; Vb: Vascular bundle; Ph: Phloem; Xy: Xylem; Me: Mesophyll cell；Fl: Flavone; Al: Alkaloid; Po: Polysaccharide; Sa: Saponin圖3 紫金龍葉的組織構(gòu)造及組織化學(xué)定位Fig.3 Tissue structure and histochemical localization in leaves of Dactylicapnos scandens

皂苷：葉中皂苷分布較少(圖3-E)，木質(zhì)部組織細(xì)胞顯淺紅色，葉肉偶見(jiàn)粉紅色滴狀皂苷類(lèi)物質(zhì)，在表皮及韌皮部組織細(xì)胞中則分布很少。各組織皂苷分布數(shù)量為維管束>葉肉>表皮。

2.4 紫金龍3種營(yíng)養(yǎng)器官黃酮、生物堿、多糖、皂苷等4類(lèi)物質(zhì)相對(duì)分布量及平均分布密度比較

在相同觀察視野面積下，對(duì)各營(yíng)養(yǎng)器官內(nèi)4種物質(zhì)的分布量進(jìn)行分析(表4)，生物堿與皂苷類(lèi)物質(zhì)在根、莖、葉中的平均分布量均呈遞減趨勢(shì)，黃酮類(lèi)物質(zhì)在葉中分布量較少，根與莖中則相似。多糖類(lèi)物質(zhì)在根中分布較多，莖、葉中分布量相似。

表4 紫金龍各器官4種化學(xué)成分分布量分析

3 討 論

通過(guò)對(duì)紫金龍3種營(yíng)養(yǎng)器官的組織構(gòu)造的切片觀察與分析，測(cè)量并闡明了導(dǎo)管、纖維、維管束、乳汁管、淀粉粒、柵欄組織等組織細(xì)胞的形態(tài)、大小或結(jié)構(gòu)等特征[21]。通過(guò)組織化學(xué)定位及分析，初步明確了紫金龍4種化學(xué)成分的組織分布、相對(duì)儲(chǔ)存量和分布密度等特征。根和莖的皮層較為寬廣，4種化學(xué)成分在薄壁組織細(xì)胞中分布較多。維管束組織中也有不同程度的分布量。這與植物基本薄壁組織儲(chǔ)存物質(zhì)和維管束運(yùn)輸物質(zhì)的基本功能相統(tǒng)一[22-23]。

關(guān)于紫金龍中生物堿類(lèi)化學(xué)成分的研究比較多，但有關(guān)化學(xué)成分及藥理活性等方面尚待深入研究。紫金龍葉和莖等非藥用部位占其總生物量的20%～25%，并且兩者的黃酮、生物堿、多糖及皂苷類(lèi)等成分均有不同程度的分布量，而這些非藥用部位常被廢棄。隨著以紫金龍為制藥原料的需求量的攀升，其藥材價(jià)格也在不斷上升，導(dǎo)致紫金龍野生資源迅速衰減，故要加強(qiáng)對(duì)非藥用部位的開(kāi)發(fā)利用，提高資源綜合利用效率[12,23]。

4 結(jié) 論

研究明確了紫金龍根、莖及葉3種營(yíng)養(yǎng)器官的顯微組織構(gòu)造類(lèi)型及特征，可以作為紫金龍正品基源植物、藥材及飲片的鑒別依據(jù)；根、莖、葉3種營(yíng)養(yǎng)器官均有黃酮、生物堿、多糖及皂苷的分布，但各自分布的部位及組織細(xì)胞有所不同。研究結(jié)果可為紫金龍資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。這對(duì)減少資源浪費(fèi)、保護(hù)及合理開(kāi)發(fā)資源具有重要意義。