葛根開花習(xí)性觀察及不同花期花粉活力的相關(guān)分析

莫周美，張秀芬，李恒銳，劉連軍，吳玲玲，賀 鵬，韋婉羚

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 龍州 532415)

【研究意義】葛根[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]為豆科蝶形花亞科的蔓生性多年生藥食兩用植物，在我國大部分省(區(qū))均有分布，享有“亞洲人參”佳譽[1-2]，可研制加工成各種功能性保健食品和藥膳食品，市場前景十分廣闊[3-5]。目前我國已選育出“湘葛系列”“贛葛系列”“宋葛系列”“橫峰系列”‘恩葛-08’‘桂葛1號’和‘桂粉葛1號’等多個葛根優(yōu)良品種[2]，葛根產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展。雜交育種是品種更新的重要手段，而花粉活力直接影響葛根雜交育種成功率。但至今關(guān)于葛根雜交育種及開花習(xí)性方面的研究報道不多。因此，觀察了解葛根的開花習(xí)性，分析其花粉活力，確定其花粉的最適宜利用時期，對葛根的有性繁育、雜交育種及葛根產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】孫奇[6]研究表明，花性器官的發(fā)生與分化由植物內(nèi)在的遺傳物質(zhì)、內(nèi)源激素及其外在環(huán)境條件共同決定。李海賢等[7]研究認為，選擇最佳雜交授粉時間有利于提高植物育種成功率。方貫?zāi)鹊萚8]研究影響豇豆雜交結(jié)莢率發(fā)現(xiàn)，選擇最佳去雄時間和授粉時間可明顯提高豇豆結(jié)莢率。張玉梅等[9]研究菜用大豆雜交授粉方法，發(fā)現(xiàn)上午去雄后立即授粉不利于花粉雜交成活，而在前一天下午先去雄次日上午再授粉，有利于提高花粉的雜交成活率。陳忠文等[10]研究豆薯開花習(xí)性發(fā)現(xiàn)，豆薯在花的旗瓣未開展前已經(jīng)完成授粉過程。王月異等[11]的研究結(jié)果顯示，在苜蓿單花旗瓣展開而翼瓣未伸出花萼時雄蕊未散粉，此時進行授粉效率較高，可以增加授粉的可信度。楊小丹等[12]研究表明，蘭花花粉活力越高其雜交授粉成功率越高，反之則越低。國內(nèi)外對葛花的研究主要集中在化學(xué)成分和藥用機理方面。戴雨霖等[13]研究發(fā)現(xiàn)，葛花中有30多種黃酮類化合物，黃酮類物質(zhì)是葛花的重要成分且含量較高。裴妙榮和丁海琪[14]從葛花中分離出7-甲氧基香豆素。張杰等[15]從葛花中分離出黃豆黃苷等多種化合物。葛花因具有解酒護肝作用而備受青睞，市場上已有以葛花為主藥的葛根飲料和葛根口服液等多種解酒產(chǎn)品出售[16]。杜鵬等[17]以葛根、葛花為主要原料研究出解酒酸乳飲料并經(jīng)動物驗證具有解酒功效。郭志芳等[18]研究出主要原料為葛花、具有醒酒功效的葛根咀嚼片。裴香萍等[19]、馬奮剛等[20]對葛花的藥材性狀、顯微特征和理化性質(zhì)進行了研究。郭坤元等[21]開展恩施地區(qū)葛根花粉活力研究，發(fā)現(xiàn)低溫儲藏條件有利于延長葛根花粉活力的保持時間；花粉萌發(fā)率受蔗糖濃度、硼酸濃度和氯化鈣濃度影響，在自然光和黑暗條件下，葛根花粉萌發(fā)率和花粉管的生長一致性無明顯差異?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對葛根化學(xué)成分分析及藥用機理的研究較多，但關(guān)于葛花開花習(xí)性和花粉活力方面的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在廣西龍州縣觀察葛根開花習(xí)性，檢測其不同開花期的花粉活力，了解葛花的生理特性，以期為葛根的雜交育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年4—12月在廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所葛根種植基地(東經(jīng)106°49′，北緯22°33′)進行，供試葛根品種為移栽的野生粉葛(扦插苗)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 2020年4月15日種植，正常大田水肥管理。每個品種種植80株，行距1.5 m，株距0.6 m，面積為72.0 m2。

1.2.2 開花習(xí)性觀察 葛根花序形成后每天系統(tǒng)觀察花蕾發(fā)育進程。參考陳忠文等[10]的方法劃分花蕾發(fā)育時期(閉萼期、露瓣期、半伸期、始開期、半開期和盛開期)。參考張靜等[22]的方法將葛根花期劃分為初花期、盛花期和末花期，其中，約5%花序花朵開放記為初花期，約50%花序花朵開放時記為盛花期，約95%花序花朵凋謝記為末花期。參考李海賢等[7]、林立等[23]的方法，在葛根盛花期標(biāo)記10個即將開放的花序，連續(xù)觀察并記錄開花進程。

1.2.3 花粉活力測定 在葛花盛花期，分別采集半伸期、始開期、半開期和盛開期的花朵，置于裝有少量清潔水的自封袋，快速帶回實驗室，參考陳忠文等[24]、郝麗紅等[25]的TTC染色法和I2-KI染色法測定花粉活力。其中，TTC染色法染色的花粉粒呈紅色表示具有較強生活力，花粉粒呈淡紅色表示活力微弱，無色為無活力；I2-KI染色法染色的花粉粒呈藍黑色表示具有較強生活力，花粉粒呈淡藍色表示活力微弱，花粉粒呈黃褐色和無色為無活力。

TTC染色法的花粉活力(%)= (染紅花粉數(shù)/視野中花粉數(shù)) ×100

I2-KI染色法的花粉活力(%)= (染藍花粉數(shù)/視野中花粉數(shù)) ×100

1.2.4 花粉萌發(fā)試驗 參考郭坤元等[21]的方法開展花粉萌發(fā)試驗。根據(jù)1.2.3中的花粉活力測定結(jié)果，選用盛花期中花粉活力最強一期的花粉開展花粉萌發(fā)試驗?；ǚ勖劝l(fā)培養(yǎng)基為0.1%硼酸+0.1%氯化鈣+不同濃度蔗糖。在雙孔凹型玻片孔內(nèi)分別滴入蔗糖濃度為5%、10%、15%和20%的培養(yǎng)基溶液，采集中午11：00—13：00的花粉，將適量花粉輕緩抖落至培養(yǎng)基上，將載玻片水平置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫(約28 ℃)培養(yǎng)45 min，重復(fù)3次。用NiKon-SMZ1270顯微鏡觀察花粉的萌發(fā)情況，每個載玻片隨機選取3個不重復(fù)的視野，統(tǒng)計萌發(fā)率(以花粉管長度大于花粉直徑視為花粉萌發(fā))?；ǚ勖劝l(fā)率(%)=萌發(fā)的花粉數(shù)/檢測的花粉總數(shù)×100。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行統(tǒng)計，以SPSS 20.0進行差異顯著性分析和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根的開花習(xí)性

觀察發(fā)現(xiàn)，供試野生粉葛花期在10月16日至11月5日，其中，10月16—19日為初花期，10月20日至11月1日為盛花期，11月2—5日為末花期，整個花期約21 d；花序為總狀花序，長度在9.6～42.4 cm，每個花序有小花9～72朵，自下向上開放，每朵小花開放2～3 d，每個花序開放5～9 d；花序開花高峰期在初花后2～3 d，其中盛開期在15：00—15：40；開花的起止時間和開花數(shù)量受天氣狀況影響，天氣晴朗、溫度較高時開花早，而陰雨天、溫度較低時開花推遲(表1)。

表1 葛根開花習(xí)性調(diào)查

從圖1可看出，葛花花蕾發(fā)育各時期表現(xiàn)為：閉萼期花瓣全部包埋在花萼中，花萼緊閉(圖1-A)；露瓣期花瓣剛從萼裂中露出，但長度未超過萼片(圖1-B)；半伸期花瓣長度明顯超過花萼(圖1-C)；始開期旗瓣上部開始分開，龍骨瓣微露，花蕾長度達最大值(圖1-D)；半開期旗瓣平展張開，翼瓣微張開(圖1-E)；盛開期小花盛開，旗瓣大于90°向上翻轉(zhuǎn)，頂端裂開，翼瓣對稱張開，龍骨瓣露出(圖1-F)。其中，閉萼期發(fā)育較緩慢，從花蕾形成到閉萼后期約14 d，顏色從黃綠色到基部微紫色再到基部往上2/3以上呈深紫色；露瓣期至半伸期發(fā)育快速，約1 d；半伸期至始開期需16～18 h，到盛開期僅需18～20 h。

A：閉萼期；B：露瓣期；C：半伸期；D：始開期；E：半開期；F：盛開期A：Calyx closed period；B：Dew petals period；C：Half stretch period；D：Presentation period；E：Half period；F：Blooming period圖1 葛根花不同發(fā)育時期的外部形態(tài)Fig.1 External form at different developmental stages of P.lobata flowers

2.2 葛花花粉活力檢測結(jié)果

2.2.1 不同檢測方法檢測的花粉活力 由表2可知，在葛根各開花期，TTC染色法測定的花粉活力均顯著低于I2-KI染色法(P<0.05，下同)，其中，TTC染色法測定的半伸期花粉活力僅18.8%，而I2-KI染色法的測定結(jié)果為82.1%；TTC染色法測定始開期、半開期和盛開期的花粉活力分別為26.1%、24.8%和22.9%，而I2-KI染色法的測定結(jié)果分別為95.3%、93.5%和92.7%。在顯微鏡下觀察染色情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC染色法的花粉粒著色較困難，且顏色較淡，不易辨別(圖2-A)，而I2-KI染色法染色迅速，著色明顯且容易區(qū)分(圖2-B)。可見，I2-KI染色法更適宜用于進行葛根花粉活力檢測。

表2 葛根花蕾不同發(fā)育期的花粉活力檢測結(jié)果

T：TTC染色法染色效果；I：I2-KI染色法染色效果T：Effect of TTC staining；I：Effect of I2-KI staining method圖2 葛根花粉不同染色方法的染色效果比較Fig.2 Pollen dyeing effect of different methods on P.lobata

2.2.2 同一檢測方法不同花蕾發(fā)育期的花粉活力 從表2和圖3可看出，葛根花蕾不同發(fā)育期的花粉活力存在明顯差異。其中，花蕾處于半伸期時其花藥的花粉囊未散粉(圖3-A)，I2-KI染色法檢測的花粉活力為82.1%，顯著低于其他3個時期(表2)；始開期時大部分花藥已散粉，量大且將柱頭包裹(圖3-B)，此時花粉活力最強，I2-KI染色法檢測的花粉活力達95.3%，但與半開期和盛開期無顯著差異(表2)；半開期時花藥已全部散粉，花粉量仍然較大(圖3-C)，I2-KI染色法檢測的花粉活力為93.5%；盛開期時I2-KI染色法檢測的花粉活力為92.7%，低于半開期，但差異不顯著(表2)?？梢姡鸹ㄔ诎腴_期至盛開期的花粉量及花粉活力均保持在較高水平，說明這些時期葛花的花粉較適宜用于開展雜交育種。

A：半伸期花蕊；B：始開期花蕊；C：半開期花蕊；D：盛開期花蕊A：Stamens of half stretch period；B：Stamens of presentation period；C：Stamens of half period；D：Stamens of blooming period圖3 葛根花蕾不同發(fā)育期的花蕊散粉情況Fig.3 Situation of stamen powder in different development stages of P.lobata

2.3 葛根花粉萌發(fā)試驗結(jié)果

由表3可知，葛根花粉在蔗糖濃度為15%的培養(yǎng)基中發(fā)芽率最高，為36.23%，顯著高于其他3個蔗糖濃度處理；在蔗糖濃度為10%的培養(yǎng)基中發(fā)芽率為12.49%，在蔗糖濃度為20%的培養(yǎng)基中發(fā)芽率為28.75%，二者差異顯著；而在蔗糖濃度為5%培養(yǎng)基中的發(fā)芽率最低，僅1.86%，且顯著低于其他3個蔗糖濃度處理?？梢?，葛根花粉在不同蔗糖濃度培養(yǎng)基中的發(fā)芽率雖然不高，但以含15%蔗糖的培養(yǎng)基最有利于葛根花粉萌發(fā)。

表3 不同蔗糖濃度對葛根花粉發(fā)芽的影響

2.4 不同花期花粉活力的相關(guān)分析

I2-KI染色法更適宜用于葛根花粉活力檢測，因此以I2-KI染色法測定的半伸期(X1)、始開期(X2)、半開期(X3)和盛開期(X4)4個花期的花粉活力值進行相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)列于表4。由表4可知，葛根不同花期的花粉活力存在一定程度的相互影響，但4個花期花粉活力間的相關(guān)性均不顯著(P>0.05，下同)。其中，半伸期花粉活力與始開期和半開期花粉活力均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.21和-0.11；半伸期花粉活力與盛開期花粉活力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97；始開期花粉活力與半開期花粉活力呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.95；始開期花粉活力與盛開期花粉活力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.02；半開期花粉活力與盛開期花粉活力呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.33。

表4 不同花期花粉活力的相關(guān)分析結(jié)果

3 討 論

植物花的形態(tài)特征和傳粉模式是反映植物有性繁殖的重要依據(jù)[26-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在廣西龍州縣，葛根的花期在10—11月，與紀寶玉等[30]觀察發(fā)現(xiàn)葛根花期在9月的結(jié)果不一致，可能與葛根品種(系)和地域環(huán)境等不同有關(guān)，但開花持續(xù)時間約21 d與紀寶玉等[30]觀察到的葛根開花持續(xù)時間一致；葛根的每朵小花持續(xù)開放2～3 d，一個花序持續(xù)開放5～9 d，花序開放的盛花期在初花后2～3 d，小花盛開時間在15：00—15：40，這些開花習(xí)性目前未見報道。

本研究參考陳忠文等[10]對豆薯、李海賢等[7]對扁蓿豆開花習(xí)性的研究方法，將葛根花蕾的發(fā)育時期劃分為閉萼期、露瓣期、半伸期、始開期、半開期和盛開期6個階段。其中，半伸期時花藥的花粉囊未散粉，到始開期時大部分花藥散粉將柱頭包裹；始開期至盛開期時花粉顏色發(fā)生變化，由金黃色變?yōu)榈S色再變?yōu)榛尹S色。本研究取樣時發(fā)現(xiàn)半伸期葛花的花粉囊雖未散粉，但部分花藥已與柱頭高度持平，且經(jīng)過檢測花粉活力已較強，雖然認為進行葛根雜交育種時在半伸期去雄較合適，但半伸期至始開期厲時16～18 h，具體在半伸期的哪個階段進行去雄最佳還有待進一步探究。

染色法是快速檢測花粉活力的常用方法[31]。周英等[32]、王剛等[33]研究認為，染色法僅能檢驗花粉的活力，實踐上還需開展花粉萌發(fā)試驗和授粉試驗，在三者的試驗結(jié)果一致或呈正相關(guān)時，染色法才能在葛根育種中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TTC染色法對葛根花粉的染色效果不佳，花粉著色較困難，且顏色深淺差異不明顯，不易辨別，可能與材料選擇有關(guān)；I2-KI染色法檢測的葛根花粉活力較強，且染色時間短、效果明顯，因此認為I2-KI染色法更適合用于葛根花粉活力檢測，與陳忠文等[24]對豆薯花粉活力的檢測結(jié)果一致，表明葛根花粉中的淀粉含量可能較高，I2-KI更容易使其花粉粒染色[34]；對不同花期的花粉活力及相關(guān)性進行分析，結(jié)果表明4個花期的花粉活力間無顯著相關(guān)性，可能與這幾個時期的花粉活力均保持在較高水平且葛花的花粉量均較多有關(guān)。

蔗糖在花粉離體培養(yǎng)中主要發(fā)揮提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓的作用[35]，硼元素是植物體內(nèi)的微量營養(yǎng)生長調(diào)節(jié)劑，對糖分的吸收具有促進作用，且可促進花粉管壁形成進而加快花粉萌發(fā)生長[36]，Ca2+的動態(tài)變化對啟動花粉萌發(fā)、調(diào)節(jié)花粉管伸長等環(huán)節(jié)也具有重要作用[37]。本研究在固定硼酸濃度和Ca2+(氯化鈣)濃度基礎(chǔ)上僅開展不同蔗糖濃度對葛根花粉萌發(fā)影響試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含15%蔗糖培養(yǎng)基中的葛根花粉萌發(fā)率顯著高于其他蔗糖濃度培養(yǎng)基，說明適宜蔗糖濃度的培養(yǎng)基對葛根花粉離體萌發(fā)具有一定促進作用；選擇始開期時的花粉(I2-KI染色法檢測結(jié)果此時花粉活力最強)進行花粉萌發(fā)試驗，但葛根花粉在含不同濃度蔗糖培養(yǎng)基中的萌發(fā)率均較低，最高只有36.23%，與郭坤元等[21]對葛根花粉的萌發(fā)試驗結(jié)果差異明顯，是否因葛根品種不同或環(huán)境氣候等因素不同而引起，還需進一步探究。

坐果率是制約植物雜交制種產(chǎn)量和授粉效率的重要因素。陳衛(wèi)國等[38]研究辣椒雜交授粉時發(fā)現(xiàn)，坐果率易受多個因素如種苗質(zhì)量和授粉植株的營養(yǎng)狀況影響，采取培育壯苗、增施基肥、協(xié)調(diào)植株營養(yǎng)與生殖生長平衡、科學(xué)栽培管理等措施可提高坐果率。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，葛根在謝花時花朵全部掉落，無一坐果，直接導(dǎo)致授粉試驗失敗。因此，葛根坐果率低是品種問題還是受環(huán)境氣候、栽培管理條件影響，有待在下一步工作中深入探討。

4 結(jié) 論

I2-KI染色法可快速檢測葛根花粉活力。葛根花粉活力在花蕾始開期至盛開期均維持在較高水平，可根據(jù)天氣狀況選取其中合適時期的花粉進行雜交授粉，從而提高葛根雜交成功率。