響應(yīng)面法優(yōu)化制備眼樹蓮總?cè)栖浉?/h1>
2022-04-05 13:42:46楊瑩琛楊莉段永霞葉帆王韜翔楊柳余邦良
熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年1期
楊瑩琛 楊莉 段永霞 葉帆 王韜翔 楊柳 余邦良
摘要以眼樹蓮總?cè)茷樵?，采?Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化制備眼樹蓮總?cè)栖浉啵ㄟ^考察其理化性質(zhì)、穩(wěn)定性以及軟膏中總?cè)坪看_定最優(yōu)軟膏基質(zhì)的處方。在硬脂酸、丙二醇、月桂氮卓酮的用量及乳化溫度單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用基質(zhì)的外觀形狀、涂展性、稠度、離心穩(wěn)定性進(jìn)行綜合性評分，利用響應(yīng)面法優(yōu)化，選取最優(yōu)的制備工藝。結(jié)果表明，最優(yōu)軟膏基質(zhì)制備處方為乳化溫度70℃，硬脂酸26%，丙二醇7%，月桂氮卓酮3%。軟膏的綜合性評分可達(dá)到最優(yōu)值，為 97分，并且分析測得軟膏中相應(yīng)的總?cè)坪枯^高。說明響應(yīng)面法優(yōu)化后的眼樹蓮總?cè)栖浉嘀苽浞椒尚行愿?，為開發(fā)制備眼樹蓮軟膏制劑奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞眼樹蓮;總?cè)?軟膏;響應(yīng)面法;制備;優(yōu)化
中圖分類號 TS202.3??????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A???????? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.015
Optimization of Preparation of Triterpenoid Ointments from Dischidia chinensis by Using Response Surface Methodology
YANG Yingchen1??? YANG Li1??? DUAN Yongxia1??? YE Fan1??? WANG Taoxiang1 YANG Liu1，2，3，4??? YU Bangliang1，2，3，4
（1. School ofPharmacy， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571119， China;2. Key Laboratory of Tropical Translational Medicine ofMinistryofEducation， Haikou， Hainan 571119， China;3. Hainan Provincial Key Laboratory for Research andDevelopment ofTropical Herbs， Haikou， Hainan 571119， China;4. Haikou Key Laboratory of
Li Nationality Medicine， Haikou， Hainan 571119， China）
Abstract?? Triterpenoids were extracted from Dischidia chinensis and used to prepare triterpenoid ointments. The physical and chemical properties and stability of the prepared ointments and the content of triterpenoids in the ointments were determined to optimize a preparation formula for a triterpenoid ointment by using Box- Behnken response surface method. Experiments with single factors： the contents of stearic acid， propylene glycol and laurocapram in the ointments and their emulsification temperature， were designed， and the appearance shape， spreading， consistency and centrifugal stability of the ointment bases were comprehensively evaluated by scoring. An optimal preparation technology was selected for the ointment by using the response surface methodology for optimization. The optimal preparation formula for the ointment base is as follows： emulsi- fication temperature 70 C， stearic acid 26%， propylene glycol 7% and laurocapram 3%. The comprehensive score of the se- lected ointment can reach the optimal value of 97， and the total triterpenoid content in the selected ointment is high. The opti- mized preparation method for the triterpenoid ointment is feasible， which lays a foundation for the development and prepara- tion of ointments from D. chinensis.
Keywords? Dischidia chinensis; triterpenoids; ointment; response surface methodology; preparation; optimization
眼樹蓮別名瓜子金、瓜子藤等，為蘿摩科眼樹蓮屬附生藤本植物，生長在中、低海拔的山地林谷或曠地，在中國主要產(chǎn)于海南、廣東和廣西等省區(qū)[1]。眼樹蓮全株入藥，有清肺化痰、涼血解毒之效，民間用于治療肺燥咳痰、咳血、百日咳、小兒積食、癡疾、齊瘡毒膿、跌打腫痛、毒蛇咬傷等[2]。海南黎族地區(qū)用其全草煮水熏眼，治療眼疾[3]。霍麗妮等[4]研究顯示，從眼樹蓮全株中得到的總酚和總黃酮具有體外抗氧化活性。本課題組成員[5-8]發(fā)現(xiàn)，海南產(chǎn)眼樹蓮不同提取物具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。前人的研究[9-10]得知，眼樹蓮藥材中的有效活性成分大部分為萜類化合物。曾慧慧等[9]獲得三萜類化合物的較優(yōu)提取方法，目前尚未有眼樹蓮萜類開發(fā)成軟膏的研究報道。
通過油脂性、乳劑型、水溶性軟膏常用基質(zhì)對比的實驗，發(fā)現(xiàn)乳劑型基質(zhì)有良好的藥物釋放能力，且促進(jìn)藥物協(xié)同作用的產(chǎn)生，顯著提升了藥物活性成分的生物利用度[11]。研究發(fā)現(xiàn)， O/W 型乳劑基質(zhì)的藥物釋放速度、滲透進(jìn)入皮膚的能力要優(yōu)于 W/O 型[12]，因此 O/W 型將作為試驗軟膏的基質(zhì)類型。本實驗通過單因素和響應(yīng)面法考察了軟膏的月桂氮卓酮，丙二醇，硬脂酸，乳化溫度這4 種因素對軟膏綜合性評分的影響，期望篩選出眼樹蓮軟膏的最優(yōu)處方，并測定眼樹蓮軟膏總?cè)频暮浚炞C其軟膏劑的抗炎效果，為眼樹蓮總?cè)茷橹魉庨_發(fā)成軟膏劑奠定基礎(chǔ)。
1? 材料與方法
1.1? 材料
1.1.1? 藥材和試劑新鮮眼樹蓮藥材于2020年 8月采自海南省?？谑行阌^(qū)，經(jīng)海南大學(xué)劉壽柏副教授鑒定，其為蘿摩科植物眼樹蓮，編號為 YSL-202008;液體石蠟、硬脂酸、羊毛脂、尼泊金乙酯、月桂氮卓酮、丙二醇、三乙醇胺均為分析純，廣西西隴化工試劑有限公司;齊墩果酸，分析標(biāo)準(zhǔn)品≥98.7%（上海阿拉丁有限公司）。
1.1.2? 儀器 KQ5200DB 超聲波清洗機(jī)（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）; ME204E 電子分析天平（梅特勒-托利多上海儀器有限公司）; TG16-WS 臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）; HH-420數(shù)顯恒溫水浴箱（上海力辰邦西儀器科技有限公司）; DFY-1000D 藥用粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）;722N 可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）; Exceed-Ad-60超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。
1.2? 方法
1.2.1? 樣品提取物的制備制備方法同曾慧慧等[9]。制得總?cè)坪繛?2.12 mg/g 的眼樹蓮提取液。
1.2.2? 眼樹蓮軟膏基質(zhì)的制備通過預(yù)實驗，明確眼樹蓮軟膏制備工藝：將液體石蠟（31.3%，質(zhì)量比，下同）、硬脂酸（23%～32%）、羊毛脂（5%）混合后加熱至相應(yīng)的溫度，作為油相;將丙二醇（3%～9%）、尼泊金乙酯（0.05%）、三乙醇胺（2.5%）、月桂氮卓酮（1%～7%）、眼樹蓮提取液（0.3%）及水置于相同溫度共同水浴，作為水相;控制攪拌速度不變，緩慢地將油相轉(zhuǎn)移入水相，在較快的攪拌速度下使軟膏劑基質(zhì)達(dá)到均一，放置適當(dāng)?shù)臏囟龋?0～80℃）中進(jìn)行水浴加熱，同等轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌15 min 至冷凝，即制備得到軟膏基質(zhì);繼續(xù)攪拌15 min 至冷凝，最后分裝即得規(guī)格為50 g 的眼樹蓮軟膏。
1.2.3? 軟膏考察指標(biāo)與評分標(biāo)準(zhǔn)參照2020 版《中國藥典》[13]，以軟膏基質(zhì)外觀性狀、離心穩(wěn)定性、延展性、黏度與稠度作為軟膏劑的考察指標(biāo)，各指標(biāo)評分之和即為軟膏的綜合性評分，總分為100分。綜合評分總分為100分，其中外觀形狀，涂展性，稠度各占20 分，離心穩(wěn)定性占40分。評分標(biāo)準(zhǔn)[14-15]見表1。
1.2.4? 單因素實驗以月桂氮卓酮（質(zhì)量比）、乳化溫度、丙二醇（質(zhì)量比）、硬脂酸（質(zhì)量比）進(jìn)行單因素實驗，考察它們對軟膏綜合性評分的影響。單因素實驗設(shè)置4 個實驗組，每個實驗組按
1.2.2的方法制得眼樹蓮軟膏基質(zhì)3 份，按照1.2.3 的方法測定眼樹蓮軟膏綜合性評分，并求其平均。初定乳化溫度為50℃，丙二醇為3%，硬脂酸為23%的條件下，分別考察月桂氮卓酮（1%、3%、 5%、7%）的影響。然后依據(jù)實驗所確定月桂氮卓酮的量，考察乳化溫度變化（50℃～80℃）的影響;采取相同的方式確定最佳的乳化溫度后，繼續(xù)考察不同的丙二醇（3%、5%、7%、9%）的影響及不同硬脂酸（23%、26%、29%、32%）影響[16]。
1.2.5? 響應(yīng)面方法優(yōu)化實驗設(shè)計基于單因素實驗結(jié)果，用 Design? Expert? 11.0 軟件，根據(jù) Box-Behnken 模型原理，篩選出4 個對軟膏劑綜合性評分產(chǎn)生顯著效果的因素，即乳化溫度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（ C ）、月桂氮卓酮（ D ）作為自變量，綜合評分（ Y ）作為因變量，建立模型優(yōu)化軟膏制法工藝，篩選出最佳軟膏基質(zhì)制備條件，響應(yīng)面優(yōu)化實驗因素和水平見表2。
1.2.6?? 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)文獻(xiàn)[8，17-18]中的方法，用電子天平準(zhǔn)確稱取齊墩果酸25.0 mg，用無水乙醇加以溶解，配得齊墩果酸溶液，其濃度為5 mg/mL;量取0.4 mL 齊墩果酸溶液，置于10 mL 的試管中，80℃水浴加熱至溶劑揮發(fā)完畢，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.6 mL ，加入高氯酸1.4 mL，混合均勻;80℃水浴加熱，時間約15 min，迅速置于冰水中冷卻15 min，用8 mL 乙酸乙酯進(jìn)行反應(yīng)，充分?jǐn)嚢杈鶆颍吹谬R墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液;對齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行等比稀釋，最終得到濃度為0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15 mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液;將1 號管作為參比，在 550 nm 波長范圍下，掃描得到每一試樣溶液的吸光度。以系列齊墩果酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)。
1.2.7? 供試品溶液的制備將響應(yīng)面優(yōu)化后的實驗條件制得眼樹蓮總?cè)栖浉?0 g，用乙醇將其萃取，配制成0.02 g/mL 的溶液，取上清液用0.22μm 針頭濾器過濾，得供試品溶液。
1.2.8? 計算眼樹蓮總?cè)栖浉嘀锌側(cè)频寐蕦?.2.7中制得的供試品溶液放在試管中，用 80℃水浴加熱至溶劑揮發(fā)完畢，在 1.2.6中方法下測定其吸光度，記錄其吸光度，根據(jù)以下公式，計算眼樹蓮總?cè)苹衔锏暮縖18]。
總?cè)频暮? m × c ×100%，式中： m 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的齊墩果酸量（ mg ）;c 為稀釋倍數(shù); M 為樣品中理論含有的總?cè)瀑|(zhì)量（ mg ）。1.2.9? 抗炎活性實驗以響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果制成一組眼樹蓮總?cè)栖浉?，用參考文獻(xiàn)[5]的1.2.3 中“二甲苯所致小鼠耳腫脹抗炎模型”方法，考察其總?cè)频目寡谆钚浴Ｈ?0只雄性昆明種小鼠，分 4組，每組各10只;以 48 mg/kg 劑量灌胃用眼樹蓮總?cè)?，作為灌胃藥物組;以 48 mg/kg 劑量外用眼樹蓮總?cè)栖浉啵鳛橥庥盟幬锝M;以1%的羧甲基纖維素水溶液作為空白對照組;以500 mg/kg 劑量灌胃阿司匹林，作為陽性藥物組。參照楊柳等[5]的方法，計算總?cè)频亩[脹抑制率。
1.2.10? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 Origin 8.5作圖， SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，設(shè)置p<0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義，采用 Design-Expert 11.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。
2? 結(jié)果與分析
2.1? 單因素實驗考察基質(zhì)組成及比例
2.1.1? 不同月桂氮卓酮添加量對軟膏綜合性評分的影響月桂氮卓酮能夠加強(qiáng)軟膏的透皮吸收，實現(xiàn)很好的促透作用，和丙二醇聯(lián)合使用能夠提高其促透作用[19]。本實驗考察了1.0%、3.0%、5.0%、7.0%不同比例的月桂氮卓酮，其他條件保持不變，月桂氮卓酮的添加比例依次得到軟膏綜合性評分分別為76，92，85，82分。實驗結(jié)果可得，隨著月桂氮卓酮的增加，基質(zhì)中的液體石蠟和凡士林阻止其分配進(jìn)入角質(zhì)層，限制了其促透作用[19]，使軟膏的綜合性評分降低，因此選定月桂氮卓酮為3.0%～7.0%作為進(jìn)一步條件篩選的范圍。
2.1.2? 不同乳化溫度對軟膏綜合性評分的影響選取乳化溫度為50、60、70、80℃進(jìn)行篩選，其他條件保持不變，乳化溫度提高依次得到軟膏綜合性評分分別為75、85、95、88分。實驗結(jié)果可得，當(dāng)乳化溫度增加時，軟膏的油相和水相在水浴中溶解更完全，制備的膏體基質(zhì)均勻性更好。如果溫度較低，制成的膏體會出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，水油分離，涂布能力較差。故擬定于60～80℃進(jìn)行篩選。?? 2.1.3? 不同丙二醇添加量對軟膏綜合性評分的影響選取丙二醇添加量為3.0%、5.0%、7.0%、9.0% 不同比例進(jìn)行篩選，其他條件保持不變，丙二醇添加量提高得到軟膏綜合性評分分別為75、90、 95、85分。實驗結(jié)果可得，當(dāng)丙二醇含量過小，膏體稠度過大、涂布性較差，軟膏綜合性評分較低。由于丙二醇是水溶性保濕劑，保濕微粒較小，量過少不會起到保濕作用，又會影響乳膏的性狀，因此選定在5.0%～9.0%進(jìn)一步篩選。
2.1.4? 不同硬脂酸添加量對軟膏綜合性評分的影響選取硬脂酸添加量為23%、26%、29%、32% 不同比例進(jìn)行篩選，其他條件保持不變，硬脂酸添加量提高得到軟膏綜合性評分分別為84、88、 92、80分。實驗結(jié)果可得，當(dāng)硬脂酸越多時，膏體涂布性和延展性變差、稠度過大，穩(wěn)定性下降，軟膏的綜合性評分減小。硬脂酸在乳膏劑中一般是乳化油狀物，硬脂酸薄膜將隨著水分蒸發(fā)產(chǎn)生，對皮膚起到保護(hù)效果，但含量過高會使乳膏變硬，潤滑作用小，量不宜過多[20]。因此選定23%～29% 進(jìn)一步篩選。
2.2? 響應(yīng)面方法優(yōu)化實驗結(jié)果
基于單因素實驗結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化眼樹蓮軟膏的基質(zhì)制備工藝，獲得隨機(jī)實驗方案及實驗數(shù)據(jù)見表3。運(yùn)用響應(yīng)面軟件回歸分析，獲得以乳化溫度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（ C ）、月桂氮卓酮（ D ）為因素水平，以眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分為評價指標(biāo)（ Y）的二次多項回歸方程式：
Y=97.40?4.42A?4.17B?0.17C+3.42D+0.50AB+
9.25AC+2.50AD?0.50BC++3.00BD+3.25CD?14.82 A2?6.95B2?8.20C2+3.17D2。
該模型p<0.0001，表明建立的模型顯著性明顯，失擬項檢驗p=0.092 6>0.05不顯著，表明該回歸模型能夠較好地擬合實際情況，可以借此模型來預(yù)判實際情況，見表4。用決定系數(shù) R2和調(diào)整決定系數(shù) R2Adj 判斷模型是否擬合[21]。R2=0.988 5、R2Adj=0.9770，數(shù)值大小相近，說明該模型完美擬合實際情況，數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確可靠，代表性好，能準(zhǔn)確預(yù)測實際情況，體現(xiàn)出實驗值與預(yù)測值之間存在著較高的關(guān)聯(lián)性[22]，因此，可以利用該模型預(yù)測眼樹蓮軟膏的最佳制備工藝;在獨(dú)立因素、因素與因素的交互作用及因素的平方項中， A、B、 D 、AC 、A2、B2、C2對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響極其顯著（p<0.0001 ），AB 、BC、D2對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響顯著（ p< 0.05），這些因素對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響較大，說明實驗數(shù)值具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，判斷實驗中所考察的4 個因素對綜合性評分的作用并不只呈現(xiàn)線性關(guān)系，其交互項、二次項同樣對軟膏的綜合性評分有著一定程度的影響。 F 值體現(xiàn)了各因素對軟膏綜合性評分的影響程度， F 值與其對響應(yīng)值（綜合性評分）的影響程度成正比，即說明該因素影響程度更大[23]。經(jīng)表3 的數(shù)據(jù)分析可知，實驗考察的4 個因素對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響程度大小的順序為乳化溫度（ A ）>硬脂酸（ B ）>月桂氮卓酮（ D ）>丙二醇（ C ）。
2.3? 響應(yīng)面交互作用及條件優(yōu)化
等高線圖和響應(yīng)面圖可以形象地反映出響應(yīng)值隨各相關(guān)因素變化所呈現(xiàn)的趨勢。運(yùn)用響應(yīng)面軟件進(jìn)行分析，繪制出乳化溫度、硬脂酸、丙二醇、月桂氮卓酮這4 個因素之間的交互作用對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合評分影響的響應(yīng)面，可以得到該模型的等高線圖和響應(yīng)面圖。從響應(yīng)面的曲面曲線來判斷，曲線走勢越陡，表示相應(yīng)的兩因素的交互作用越顯著[24]，對響應(yīng)值的影響也越大，當(dāng)響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面時，特征值均為正值，有極小值存在;當(dāng)響應(yīng)面圖呈現(xiàn)山丘狀的曲面時，則所對應(yīng)的特征值應(yīng)為負(fù)值，說明模型存在極大值;當(dāng)響應(yīng)面圖呈現(xiàn)馬鞍形的曲面時，則所對應(yīng)的特征值有正有負(fù)，說明模型無極值[25]。若等高線圖曲線形狀為橢圓形，則對應(yīng)兩因素的交互作用顯著，倘若曲線形狀為圓形，則交互作用不顯著，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。分析不同因素間的等高線圖和響應(yīng)面圖的差異，可以直觀形象地判斷出兩因素之間的交互作用以及交互作用的強(qiáng)弱，并且能夠看出對響應(yīng)值的影響程度。
2.3.1? 乳化溫度（ A ）與硬脂酸（B ）交互作用從圖1 可知，乳化溫度（ A ）與硬脂酸（ B ）的等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面成山丘形，并且響應(yīng)面的曲面曲線走勢較緩，說明這兩種因素的交互作用對軟膏的綜合性評分的影響較為顯著。由曲線可知，隨著乳化溫度（ A ）和硬脂酸（ B ）的增加，軟膏的綜合性評分也不斷緩慢增加，直至達(dá)到極值。到達(dá)極值之后，綜合性評分逐漸下降，表明乳化溫度（ A ）與硬脂酸（B ）交互作用較為顯著，響應(yīng)值有極大值存在。
2.3.2? 乳化溫度（ A ）與丙二醇（C ）交互作用從圖 2可知，乳化溫度（ A ）與丙二醇（ C ）的等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面成山丘形，并且響應(yīng)面的曲面曲線走勢較陡，說明這兩種因素的交互作用對軟膏的綜合性評分的影響顯著。由響應(yīng)面曲線走勢可知，隨著乳化溫度（ A ）和丙二醇（ C ）的增加，軟膏的綜合性評分也不斷增加，直至達(dá)到極值。到達(dá)極值之后，綜合性評分驟然下降，表明乳化溫度（ A ）與丙二醇（ C ）交互作用極為顯著，響應(yīng)值有極大值存在。
2.3.3? 硬脂酸（ B ）與丙二醇（ C ）交互作用從圖 3可知，硬脂酸（ B ）與丙二醇（ C ）的等高線曲線形狀趨向近圓形，說明2 個因素間的交互作用對眼樹蓮軟膏的綜合性評分影響不顯著[26]。觀察響應(yīng)面圖形曲線得出，隨著硬脂酸和丙二醇的增加，軟膏的綜合性評分也不斷緩慢增加，直至達(dá)到極值。由于等高線圖成近圓形，所以 BC 交互作用存在多個極值，難以確定兩個因素對軟膏綜合性評分的交互作用。
2.3.4? 乳化溫度（ A ）、硬脂酸（B ）、丙二醇（C ）與月桂氮卓酮（ D ）交互作用由圖4 可知，乳化溫度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（C ）與月桂氮卓酮（ D ）交互作用之間的響應(yīng)面圖呈現(xiàn)馬鞍形曲面，即這三組交互作用不存在極值，交互作用不顯著，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
上述與回歸模型方差分析相符，據(jù) Design- Expert11.0 建立模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，以軟膏最高綜合性評分為優(yōu)化目標(biāo)，可得到最佳工藝：乳化溫度75.05℃，硬脂酸為27.68%，丙二醇為8.66%，月桂氮卓酮為5.00%，預(yù)測綜合評分值為97.4分。根據(jù)實驗條件進(jìn)行修正：乳化溫度70℃，硬脂酸為26%，丙二醇為7%，月桂氮卓酮為5%，并按照響應(yīng)面優(yōu)化后的條件，采用三萜化合物含量測定方法進(jìn)行驗證實驗確認(rèn)條件可行性。
2.4? 驗證實驗
2.4.1? 軟膏最佳制備工藝驗證選擇修正后制備條件為：乳化溫度70℃，硬脂酸為26%，丙二醇為 7%，月桂氮卓酮為3%。經(jīng)過三次平行實驗后，分別得到眼樹蓮軟膏的綜合性評分為97，96，98，平均為97分，其與預(yù)測值97.4分接近， RSD 值為 1.03%，說明誤差較小，說明所建立的響應(yīng)面優(yōu)化模型真實可靠，結(jié)果表明該優(yōu)化的軟膏制備工藝具有重現(xiàn)性。
2.4.2? 眼樹蓮軟膏中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定實驗得到濃度為0 、0.01、0.02、0.05、0.10、 0.15 mg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在550 nm 波長范圍下，以系列齊墩果酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=8.2651 x+0.0168，R2=0.999?；貧w分析濃度在0.0～0.15 mg/mL，吸光度與其溶液濃度成比例遞增，可用于計算軟膏中總?cè)频暮?。測得供試品的吸光度值，通過1.2.8公式計算得眼樹蓮軟膏中總?cè)祁惖暮?，?98.6%。結(jié)果表明，經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化之后的眼樹蓮三萜類軟膏中三萜類化合物的含量較高。
2.4.3? 眼樹蓮軟膏抗炎活性實驗眼樹蓮軟膏抗炎活性實驗結(jié)果見表6?？梢园l(fā)現(xiàn)，眼樹蓮軟膏外用能夠抑制小鼠耳腫脹，與空白對照組比較，耳腫脹抑制率為45.35%，說明眼樹蓮軟膏外用具有一定抗炎活性。
3? 結(jié)論
目前，已知眼樹蓮總?cè)铺崛∥锞哂辛己玫目寡仔Ч?，但是對于制備成軟膏的相關(guān)研究還存在空白。楊俊等[22]對虎耳草軟膏劑成型工藝進(jìn)行了優(yōu)選，張榮榕等[25]采用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化金鑒靈軟膏的制備工藝，陳麗梅等[27]響應(yīng)面法優(yōu)化乳膏基質(zhì)工藝參數(shù)均獲得了較好的乳膏基質(zhì)工藝參數(shù)。綜合上述研究，采用單因素實驗及 Box- Behnken 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝，獲得眼樹蓮總?cè)栖浉噍^為準(zhǔn)確的工藝參數(shù)。
響應(yīng)面分析是通過優(yōu)化實驗條件合理設(shè)計的方法，綜合運(yùn)用回歸方程來擬合影響因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，從而獲得尋找最佳響應(yīng)值的統(tǒng)計方法[28]。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計相比，既能體現(xiàn)提取過程中不同因素之間的交互作用關(guān)系，又能更加精確地篩選出提取工藝的最佳點，對于非線性響應(yīng)因素的預(yù)測具有較強(qiáng)的指導(dǎo)性，應(yīng)用價值較高[29]。通過單因素篩選實驗，探究各因素對軟膏綜合性評分程度，最后借助響應(yīng)面法優(yōu)化眼樹蓮總?cè)栖浉嗷|(zhì)制備工藝，最佳基質(zhì)制備工藝結(jié)果為乳化溫度70℃，硬脂酸為26%，丙二醇為7%，月桂氮卓酮為3%。在此條件下，軟膏的綜合性評分可達(dá)到最優(yōu)值97分，并且得軟膏中相應(yīng)的總?cè)坪枯^高。結(jié)果說明該軟膏基質(zhì)制備工藝具有較好的實用性，為進(jìn)一步開發(fā)研制眼樹蓮作用的藥物制劑提供一定的參考價值和理論依據(jù)。
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（責(zé)任編輯龍婭麗）
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楊瑩琛 楊莉 段永霞 葉帆 王韜翔 楊柳 余邦良
摘要以眼樹蓮總?cè)茷樵?，采?Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化制備眼樹蓮總?cè)栖浉啵ㄟ^考察其理化性質(zhì)、穩(wěn)定性以及軟膏中總?cè)坪看_定最優(yōu)軟膏基質(zhì)的處方。在硬脂酸、丙二醇、月桂氮卓酮的用量及乳化溫度單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用基質(zhì)的外觀形狀、涂展性、稠度、離心穩(wěn)定性進(jìn)行綜合性評分，利用響應(yīng)面法優(yōu)化，選取最優(yōu)的制備工藝。結(jié)果表明，最優(yōu)軟膏基質(zhì)制備處方為乳化溫度70℃，硬脂酸26%，丙二醇7%，月桂氮卓酮3%。軟膏的綜合性評分可達(dá)到最優(yōu)值，為 97分，并且分析測得軟膏中相應(yīng)的總?cè)坪枯^高。說明響應(yīng)面法優(yōu)化后的眼樹蓮總?cè)栖浉嘀苽浞椒尚行愿?，為開發(fā)制備眼樹蓮軟膏制劑奠定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞眼樹蓮;總?cè)?軟膏;響應(yīng)面法;制備;優(yōu)化
中圖分類號 TS202.3??????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A???????? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.015
Optimization of Preparation of Triterpenoid Ointments from Dischidia chinensis by Using Response Surface Methodology
YANG Yingchen1??? YANG Li1??? DUAN Yongxia1??? YE Fan1??? WANG Taoxiang1 YANG Liu1，2，3，4??? YU Bangliang1，2，3，4
（1. School ofPharmacy， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571119， China;2. Key Laboratory of Tropical Translational Medicine ofMinistryofEducation， Haikou， Hainan 571119， China;3. Hainan Provincial Key Laboratory for Research andDevelopment ofTropical Herbs， Haikou， Hainan 571119， China;4. Haikou Key Laboratory of
Li Nationality Medicine， Haikou， Hainan 571119， China）
Abstract?? Triterpenoids were extracted from Dischidia chinensis and used to prepare triterpenoid ointments. The physical and chemical properties and stability of the prepared ointments and the content of triterpenoids in the ointments were determined to optimize a preparation formula for a triterpenoid ointment by using Box- Behnken response surface method. Experiments with single factors： the contents of stearic acid， propylene glycol and laurocapram in the ointments and their emulsification temperature， were designed， and the appearance shape， spreading， consistency and centrifugal stability of the ointment bases were comprehensively evaluated by scoring. An optimal preparation technology was selected for the ointment by using the response surface methodology for optimization. The optimal preparation formula for the ointment base is as follows： emulsi- fication temperature 70 C， stearic acid 26%， propylene glycol 7% and laurocapram 3%. The comprehensive score of the se- lected ointment can reach the optimal value of 97， and the total triterpenoid content in the selected ointment is high. The opti- mized preparation method for the triterpenoid ointment is feasible， which lays a foundation for the development and prepara- tion of ointments from D. chinensis.
Keywords? Dischidia chinensis; triterpenoids; ointment; response surface methodology; preparation; optimization
眼樹蓮別名瓜子金、瓜子藤等，為蘿摩科眼樹蓮屬附生藤本植物，生長在中、低海拔的山地林谷或曠地，在中國主要產(chǎn)于海南、廣東和廣西等省區(qū)[1]。眼樹蓮全株入藥，有清肺化痰、涼血解毒之效，民間用于治療肺燥咳痰、咳血、百日咳、小兒積食、癡疾、齊瘡毒膿、跌打腫痛、毒蛇咬傷等[2]。海南黎族地區(qū)用其全草煮水熏眼，治療眼疾[3]。霍麗妮等[4]研究顯示，從眼樹蓮全株中得到的總酚和總黃酮具有體外抗氧化活性。本課題組成員[5-8]發(fā)現(xiàn)，海南產(chǎn)眼樹蓮不同提取物具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。前人的研究[9-10]得知，眼樹蓮藥材中的有效活性成分大部分為萜類化合物。曾慧慧等[9]獲得三萜類化合物的較優(yōu)提取方法，目前尚未有眼樹蓮萜類開發(fā)成軟膏的研究報道。
通過油脂性、乳劑型、水溶性軟膏常用基質(zhì)對比的實驗，發(fā)現(xiàn)乳劑型基質(zhì)有良好的藥物釋放能力，且促進(jìn)藥物協(xié)同作用的產(chǎn)生，顯著提升了藥物活性成分的生物利用度[11]。研究發(fā)現(xiàn)， O/W 型乳劑基質(zhì)的藥物釋放速度、滲透進(jìn)入皮膚的能力要優(yōu)于 W/O 型[12]，因此 O/W 型將作為試驗軟膏的基質(zhì)類型。本實驗通過單因素和響應(yīng)面法考察了軟膏的月桂氮卓酮，丙二醇，硬脂酸，乳化溫度這4 種因素對軟膏綜合性評分的影響，期望篩選出眼樹蓮軟膏的最優(yōu)處方，并測定眼樹蓮軟膏總?cè)频暮浚炞C其軟膏劑的抗炎效果，為眼樹蓮總?cè)茷橹魉庨_發(fā)成軟膏劑奠定基礎(chǔ)。
1? 材料與方法
1.1? 材料
1.1.1? 藥材和試劑新鮮眼樹蓮藥材于2020年 8月采自海南省?？谑行阌^(qū)，經(jīng)海南大學(xué)劉壽柏副教授鑒定，其為蘿摩科植物眼樹蓮，編號為 YSL-202008;液體石蠟、硬脂酸、羊毛脂、尼泊金乙酯、月桂氮卓酮、丙二醇、三乙醇胺均為分析純，廣西西隴化工試劑有限公司;齊墩果酸，分析標(biāo)準(zhǔn)品≥98.7%（上海阿拉丁有限公司）。
1.1.2? 儀器 KQ5200DB 超聲波清洗機(jī)（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）; ME204E 電子分析天平（梅特勒-托利多上海儀器有限公司）; TG16-WS 臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）; HH-420數(shù)顯恒溫水浴箱（上海力辰邦西儀器科技有限公司）; DFY-1000D 藥用粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）;722N 可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）; Exceed-Ad-60超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。
1.2? 方法
1.2.1? 樣品提取物的制備制備方法同曾慧慧等[9]。制得總?cè)坪繛?2.12 mg/g 的眼樹蓮提取液。
1.2.2? 眼樹蓮軟膏基質(zhì)的制備通過預(yù)實驗，明確眼樹蓮軟膏制備工藝：將液體石蠟（31.3%，質(zhì)量比，下同）、硬脂酸（23%～32%）、羊毛脂（5%）混合后加熱至相應(yīng)的溫度，作為油相;將丙二醇（3%～9%）、尼泊金乙酯（0.05%）、三乙醇胺（2.5%）、月桂氮卓酮（1%～7%）、眼樹蓮提取液（0.3%）及水置于相同溫度共同水浴，作為水相;控制攪拌速度不變，緩慢地將油相轉(zhuǎn)移入水相，在較快的攪拌速度下使軟膏劑基質(zhì)達(dá)到均一，放置適當(dāng)?shù)臏囟龋?0～80℃）中進(jìn)行水浴加熱，同等轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌15 min 至冷凝，即制備得到軟膏基質(zhì);繼續(xù)攪拌15 min 至冷凝，最后分裝即得規(guī)格為50 g 的眼樹蓮軟膏。
1.2.3? 軟膏考察指標(biāo)與評分標(biāo)準(zhǔn)參照2020 版《中國藥典》[13]，以軟膏基質(zhì)外觀性狀、離心穩(wěn)定性、延展性、黏度與稠度作為軟膏劑的考察指標(biāo)，各指標(biāo)評分之和即為軟膏的綜合性評分，總分為100分。綜合評分總分為100分，其中外觀形狀，涂展性，稠度各占20 分，離心穩(wěn)定性占40分。評分標(biāo)準(zhǔn)[14-15]見表1。
1.2.4? 單因素實驗以月桂氮卓酮（質(zhì)量比）、乳化溫度、丙二醇（質(zhì)量比）、硬脂酸（質(zhì)量比）進(jìn)行單因素實驗，考察它們對軟膏綜合性評分的影響。單因素實驗設(shè)置4 個實驗組，每個實驗組按
1.2.2的方法制得眼樹蓮軟膏基質(zhì)3 份，按照1.2.3 的方法測定眼樹蓮軟膏綜合性評分，并求其平均。初定乳化溫度為50℃，丙二醇為3%，硬脂酸為23%的條件下，分別考察月桂氮卓酮（1%、3%、 5%、7%）的影響。然后依據(jù)實驗所確定月桂氮卓酮的量，考察乳化溫度變化（50℃～80℃）的影響;采取相同的方式確定最佳的乳化溫度后，繼續(xù)考察不同的丙二醇（3%、5%、7%、9%）的影響及不同硬脂酸（23%、26%、29%、32%）影響[16]。
1.2.5? 響應(yīng)面方法優(yōu)化實驗設(shè)計基于單因素實驗結(jié)果，用 Design? Expert? 11.0 軟件，根據(jù) Box-Behnken 模型原理，篩選出4 個對軟膏劑綜合性評分產(chǎn)生顯著效果的因素，即乳化溫度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（ C ）、月桂氮卓酮（ D ）作為自變量，綜合評分（ Y ）作為因變量，建立模型優(yōu)化軟膏制法工藝，篩選出最佳軟膏基質(zhì)制備條件，響應(yīng)面優(yōu)化實驗因素和水平見表2。
1.2.6?? 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)文獻(xiàn)[8，17-18]中的方法，用電子天平準(zhǔn)確稱取齊墩果酸25.0 mg，用無水乙醇加以溶解，配得齊墩果酸溶液，其濃度為5 mg/mL;量取0.4 mL 齊墩果酸溶液，置于10 mL 的試管中，80℃水浴加熱至溶劑揮發(fā)完畢，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.6 mL ，加入高氯酸1.4 mL，混合均勻;80℃水浴加熱，時間約15 min，迅速置于冰水中冷卻15 min，用8 mL 乙酸乙酯進(jìn)行反應(yīng)，充分?jǐn)嚢杈鶆颍吹谬R墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液;對齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行等比稀釋，最終得到濃度為0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15 mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液;將1 號管作為參比，在 550 nm 波長范圍下，掃描得到每一試樣溶液的吸光度。以系列齊墩果酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)。
1.2.7? 供試品溶液的制備將響應(yīng)面優(yōu)化后的實驗條件制得眼樹蓮總?cè)栖浉?0 g，用乙醇將其萃取，配制成0.02 g/mL 的溶液，取上清液用0.22μm 針頭濾器過濾，得供試品溶液。
1.2.8? 計算眼樹蓮總?cè)栖浉嘀锌側(cè)频寐蕦?.2.7中制得的供試品溶液放在試管中，用 80℃水浴加熱至溶劑揮發(fā)完畢，在 1.2.6中方法下測定其吸光度，記錄其吸光度，根據(jù)以下公式，計算眼樹蓮總?cè)苹衔锏暮縖18]。
總?cè)频暮? m × c ×100%，式中： m 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的齊墩果酸量（ mg ）;c 為稀釋倍數(shù); M 為樣品中理論含有的總?cè)瀑|(zhì)量（ mg ）。1.2.9? 抗炎活性實驗以響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果制成一組眼樹蓮總?cè)栖浉?，用參考文獻(xiàn)[5]的1.2.3 中“二甲苯所致小鼠耳腫脹抗炎模型”方法，考察其總?cè)频目寡谆钚浴Ｈ?0只雄性昆明種小鼠，分 4組，每組各10只;以 48 mg/kg 劑量灌胃用眼樹蓮總?cè)?，作為灌胃藥物組;以 48 mg/kg 劑量外用眼樹蓮總?cè)栖浉啵鳛橥庥盟幬锝M;以1%的羧甲基纖維素水溶液作為空白對照組;以500 mg/kg 劑量灌胃阿司匹林，作為陽性藥物組。參照楊柳等[5]的方法，計算總?cè)频亩[脹抑制率。
1.2.10? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 Origin 8.5作圖， SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，設(shè)置p<0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義，采用 Design-Expert 11.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。
2? 結(jié)果與分析
2.1? 單因素實驗考察基質(zhì)組成及比例
2.1.1? 不同月桂氮卓酮添加量對軟膏綜合性評分的影響月桂氮卓酮能夠加強(qiáng)軟膏的透皮吸收，實現(xiàn)很好的促透作用，和丙二醇聯(lián)合使用能夠提高其促透作用[19]。本實驗考察了1.0%、3.0%、5.0%、7.0%不同比例的月桂氮卓酮，其他條件保持不變，月桂氮卓酮的添加比例依次得到軟膏綜合性評分分別為76，92，85，82分。實驗結(jié)果可得，隨著月桂氮卓酮的增加，基質(zhì)中的液體石蠟和凡士林阻止其分配進(jìn)入角質(zhì)層，限制了其促透作用[19]，使軟膏的綜合性評分降低，因此選定月桂氮卓酮為3.0%～7.0%作為進(jìn)一步條件篩選的范圍。
2.1.2? 不同乳化溫度對軟膏綜合性評分的影響選取乳化溫度為50、60、70、80℃進(jìn)行篩選，其他條件保持不變，乳化溫度提高依次得到軟膏綜合性評分分別為75、85、95、88分。實驗結(jié)果可得，當(dāng)乳化溫度增加時，軟膏的油相和水相在水浴中溶解更完全，制備的膏體基質(zhì)均勻性更好。如果溫度較低，制成的膏體會出現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，水油分離，涂布能力較差。故擬定于60～80℃進(jìn)行篩選。?? 2.1.3? 不同丙二醇添加量對軟膏綜合性評分的影響選取丙二醇添加量為3.0%、5.0%、7.0%、9.0% 不同比例進(jìn)行篩選，其他條件保持不變，丙二醇添加量提高得到軟膏綜合性評分分別為75、90、 95、85分。實驗結(jié)果可得，當(dāng)丙二醇含量過小，膏體稠度過大、涂布性較差，軟膏綜合性評分較低。由于丙二醇是水溶性保濕劑，保濕微粒較小，量過少不會起到保濕作用，又會影響乳膏的性狀，因此選定在5.0%～9.0%進(jìn)一步篩選。
2.1.4? 不同硬脂酸添加量對軟膏綜合性評分的影響選取硬脂酸添加量為23%、26%、29%、32% 不同比例進(jìn)行篩選，其他條件保持不變，硬脂酸添加量提高得到軟膏綜合性評分分別為84、88、 92、80分。實驗結(jié)果可得，當(dāng)硬脂酸越多時，膏體涂布性和延展性變差、稠度過大，穩(wěn)定性下降，軟膏的綜合性評分減小。硬脂酸在乳膏劑中一般是乳化油狀物，硬脂酸薄膜將隨著水分蒸發(fā)產(chǎn)生，對皮膚起到保護(hù)效果，但含量過高會使乳膏變硬，潤滑作用小，量不宜過多[20]。因此選定23%～29% 進(jìn)一步篩選。
2.2? 響應(yīng)面方法優(yōu)化實驗結(jié)果
基于單因素實驗結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化眼樹蓮軟膏的基質(zhì)制備工藝，獲得隨機(jī)實驗方案及實驗數(shù)據(jù)見表3。運(yùn)用響應(yīng)面軟件回歸分析，獲得以乳化溫度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（ C ）、月桂氮卓酮（ D ）為因素水平，以眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分為評價指標(biāo)（ Y）的二次多項回歸方程式：
Y=97.40?4.42A?4.17B?0.17C+3.42D+0.50AB+
9.25AC+2.50AD?0.50BC++3.00BD+3.25CD?14.82 A2?6.95B2?8.20C2+3.17D2。
該模型p<0.0001，表明建立的模型顯著性明顯，失擬項檢驗p=0.092 6>0.05不顯著，表明該回歸模型能夠較好地擬合實際情況，可以借此模型來預(yù)判實際情況，見表4。用決定系數(shù) R2和調(diào)整決定系數(shù) R2Adj 判斷模型是否擬合[21]。R2=0.988 5、R2Adj=0.9770，數(shù)值大小相近，說明該模型完美擬合實際情況，數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確可靠，代表性好，能準(zhǔn)確預(yù)測實際情況，體現(xiàn)出實驗值與預(yù)測值之間存在著較高的關(guān)聯(lián)性[22]，因此，可以利用該模型預(yù)測眼樹蓮軟膏的最佳制備工藝;在獨(dú)立因素、因素與因素的交互作用及因素的平方項中， A、B、 D 、AC 、A2、B2、C2對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響極其顯著（p<0.0001 ），AB 、BC、D2對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響顯著（ p< 0.05），這些因素對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響較大，說明實驗數(shù)值具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，判斷實驗中所考察的4 個因素對綜合性評分的作用并不只呈現(xiàn)線性關(guān)系，其交互項、二次項同樣對軟膏的綜合性評分有著一定程度的影響。 F 值體現(xiàn)了各因素對軟膏綜合性評分的影響程度， F 值與其對響應(yīng)值（綜合性評分）的影響程度成正比，即說明該因素影響程度更大[23]。經(jīng)表3 的數(shù)據(jù)分析可知，實驗考察的4 個因素對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合性評分影響程度大小的順序為乳化溫度（ A ）>硬脂酸（ B ）>月桂氮卓酮（ D ）>丙二醇（ C ）。
2.3? 響應(yīng)面交互作用及條件優(yōu)化
等高線圖和響應(yīng)面圖可以形象地反映出響應(yīng)值隨各相關(guān)因素變化所呈現(xiàn)的趨勢。運(yùn)用響應(yīng)面軟件進(jìn)行分析，繪制出乳化溫度、硬脂酸、丙二醇、月桂氮卓酮這4 個因素之間的交互作用對眼樹蓮總?cè)栖浉嗑C合評分影響的響應(yīng)面，可以得到該模型的等高線圖和響應(yīng)面圖。從響應(yīng)面的曲面曲線來判斷，曲線走勢越陡，表示相應(yīng)的兩因素的交互作用越顯著[24]，對響應(yīng)值的影響也越大，當(dāng)響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面時，特征值均為正值，有極小值存在;當(dāng)響應(yīng)面圖呈現(xiàn)山丘狀的曲面時，則所對應(yīng)的特征值應(yīng)為負(fù)值，說明模型存在極大值;當(dāng)響應(yīng)面圖呈現(xiàn)馬鞍形的曲面時，則所對應(yīng)的特征值有正有負(fù)，說明模型無極值[25]。若等高線圖曲線形狀為橢圓形，則對應(yīng)兩因素的交互作用顯著，倘若曲線形狀為圓形，則交互作用不顯著，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。分析不同因素間的等高線圖和響應(yīng)面圖的差異，可以直觀形象地判斷出兩因素之間的交互作用以及交互作用的強(qiáng)弱，并且能夠看出對響應(yīng)值的影響程度。
2.3.1? 乳化溫度（ A ）與硬脂酸（B ）交互作用從圖1 可知，乳化溫度（ A ）與硬脂酸（ B ）的等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面成山丘形，并且響應(yīng)面的曲面曲線走勢較緩，說明這兩種因素的交互作用對軟膏的綜合性評分的影響較為顯著。由曲線可知，隨著乳化溫度（ A ）和硬脂酸（ B ）的增加，軟膏的綜合性評分也不斷緩慢增加，直至達(dá)到極值。到達(dá)極值之后，綜合性評分逐漸下降，表明乳化溫度（ A ）與硬脂酸（B ）交互作用較為顯著，響應(yīng)值有極大值存在。
2.3.2? 乳化溫度（ A ）與丙二醇（C ）交互作用從圖 2可知，乳化溫度（ A ）與丙二醇（ C ）的等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面成山丘形，并且響應(yīng)面的曲面曲線走勢較陡，說明這兩種因素的交互作用對軟膏的綜合性評分的影響顯著。由響應(yīng)面曲線走勢可知，隨著乳化溫度（ A ）和丙二醇（ C ）的增加，軟膏的綜合性評分也不斷增加，直至達(dá)到極值。到達(dá)極值之后，綜合性評分驟然下降，表明乳化溫度（ A ）與丙二醇（ C ）交互作用極為顯著，響應(yīng)值有極大值存在。
2.3.3? 硬脂酸（ B ）與丙二醇（ C ）交互作用從圖 3可知，硬脂酸（ B ）與丙二醇（ C ）的等高線曲線形狀趨向近圓形，說明2 個因素間的交互作用對眼樹蓮軟膏的綜合性評分影響不顯著[26]。觀察響應(yīng)面圖形曲線得出，隨著硬脂酸和丙二醇的增加，軟膏的綜合性評分也不斷緩慢增加，直至達(dá)到極值。由于等高線圖成近圓形，所以 BC 交互作用存在多個極值，難以確定兩個因素對軟膏綜合性評分的交互作用。
2.3.4? 乳化溫度（ A ）、硬脂酸（B ）、丙二醇（C ）與月桂氮卓酮（ D ）交互作用由圖4 可知，乳化溫度（ A ）、硬脂酸（ B ）、丙二醇（C ）與月桂氮卓酮（ D ）交互作用之間的響應(yīng)面圖呈現(xiàn)馬鞍形曲面，即這三組交互作用不存在極值，交互作用不顯著，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
上述與回歸模型方差分析相符，據(jù) Design- Expert11.0 建立模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，以軟膏最高綜合性評分為優(yōu)化目標(biāo)，可得到最佳工藝：乳化溫度75.05℃，硬脂酸為27.68%，丙二醇為8.66%，月桂氮卓酮為5.00%，預(yù)測綜合評分值為97.4分。根據(jù)實驗條件進(jìn)行修正：乳化溫度70℃，硬脂酸為26%，丙二醇為7%，月桂氮卓酮為5%，并按照響應(yīng)面優(yōu)化后的條件，采用三萜化合物含量測定方法進(jìn)行驗證實驗確認(rèn)條件可行性。
2.4? 驗證實驗
2.4.1? 軟膏最佳制備工藝驗證選擇修正后制備條件為：乳化溫度70℃，硬脂酸為26%，丙二醇為 7%，月桂氮卓酮為3%。經(jīng)過三次平行實驗后，分別得到眼樹蓮軟膏的綜合性評分為97，96，98，平均為97分，其與預(yù)測值97.4分接近， RSD 值為 1.03%，說明誤差較小，說明所建立的響應(yīng)面優(yōu)化模型真實可靠，結(jié)果表明該優(yōu)化的軟膏制備工藝具有重現(xiàn)性。
2.4.2? 眼樹蓮軟膏中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定實驗得到濃度為0 、0.01、0.02、0.05、0.10、 0.15 mg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在550 nm 波長范圍下，以系列齊墩果酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=8.2651 x+0.0168，R2=0.999?；貧w分析濃度在0.0～0.15 mg/mL，吸光度與其溶液濃度成比例遞增，可用于計算軟膏中總?cè)频暮?。測得供試品的吸光度值，通過1.2.8公式計算得眼樹蓮軟膏中總?cè)祁惖暮?，?98.6%。結(jié)果表明，經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化之后的眼樹蓮三萜類軟膏中三萜類化合物的含量較高。
2.4.3? 眼樹蓮軟膏抗炎活性實驗眼樹蓮軟膏抗炎活性實驗結(jié)果見表6?？梢园l(fā)現(xiàn)，眼樹蓮軟膏外用能夠抑制小鼠耳腫脹，與空白對照組比較，耳腫脹抑制率為45.35%，說明眼樹蓮軟膏外用具有一定抗炎活性。
3? 結(jié)論
目前，已知眼樹蓮總?cè)铺崛∥锞哂辛己玫目寡仔Ч?，但是對于制備成軟膏的相關(guān)研究還存在空白。楊俊等[22]對虎耳草軟膏劑成型工藝進(jìn)行了優(yōu)選，張榮榕等[25]采用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化金鑒靈軟膏的制備工藝，陳麗梅等[27]響應(yīng)面法優(yōu)化乳膏基質(zhì)工藝參數(shù)均獲得了較好的乳膏基質(zhì)工藝參數(shù)。綜合上述研究，采用單因素實驗及 Box- Behnken 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝，獲得眼樹蓮總?cè)栖浉噍^為準(zhǔn)確的工藝參數(shù)。
響應(yīng)面分析是通過優(yōu)化實驗條件合理設(shè)計的方法，綜合運(yùn)用回歸方程來擬合影響因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，從而獲得尋找最佳響應(yīng)值的統(tǒng)計方法[28]。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計相比，既能體現(xiàn)提取過程中不同因素之間的交互作用關(guān)系，又能更加精確地篩選出提取工藝的最佳點，對于非線性響應(yīng)因素的預(yù)測具有較強(qiáng)的指導(dǎo)性，應(yīng)用價值較高[29]。通過單因素篩選實驗，探究各因素對軟膏綜合性評分程度，最后借助響應(yīng)面法優(yōu)化眼樹蓮總?cè)栖浉嗷|(zhì)制備工藝，最佳基質(zhì)制備工藝結(jié)果為乳化溫度70℃，硬脂酸為26%，丙二醇為7%，月桂氮卓酮為3%。在此條件下，軟膏的綜合性評分可達(dá)到最優(yōu)值97分，并且得軟膏中相應(yīng)的總?cè)坪枯^高。結(jié)果說明該軟膏基質(zhì)制備工藝具有較好的實用性，為進(jìn)一步開發(fā)研制眼樹蓮作用的藥物制劑提供一定的參考價值和理論依據(jù)。
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（責(zé)任編輯龍婭麗）
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