月季粉扇離體快繁技術(shù)研究

劉揚 李宏楊 許惠秋 張貽雷 梁靜萍 陳冠銘

摘要為了建立月季粉扇離體快繁技術(shù)體系，以月季粉扇的健壯枝條為外植體，研究外植體的消毒、叢生芽誘導、叢生芽增殖、生根壯苗及煉苗移栽，建立一套適合月季粉扇的離體快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明，外植體消毒的最佳方法為 75%的酒精消毒1 min+0.1% HgCl2消毒15 min，培養(yǎng)基添加1 mL/L 山農(nóng)1 號，污染率為12%，成活率可達74%; WPM+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+山農(nóng)1 號（外植體型）1 mL/L 叢生芽誘導效果較佳，平均芽數(shù)可達2.06，誘芽率為 96%;將誘導出來的叢生芽接種在增殖培養(yǎng)基中進行叢生芽增殖，最佳培養(yǎng)基為 WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ GA32.0 mg/L，接種45 d 增值系數(shù)達4.10，誘芽率達100%;將叢生芽切成單株，接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d，最終篩選出最佳生根培養(yǎng)基為 WPM+NAA 0.5 mg/L，平均根數(shù)達5.0，生根率100%;煉苗移栽至蔭棚7 d 成活率為90%，30 d 后移栽到大田的成活率為75%。初步建立月季粉扇離體快繁技術(shù)體系，解決了粉扇在三亞地區(qū)品種復壯及育苗問題，為月季粉扇的快速繁殖和種質(zhì)資源保存提供理論和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞粉扇;離體快繁;叢生芽誘導;生根

中圖分類號 S685.12??????? 文獻標識碼 A???????? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.008

Rapid Propagation ofRosa ‘Fenshan’ Through Tissue Culture

LIU Yang1，3??? LI Hongyang1??? XU Huiqiu2??? ZHANG Yilei2??? LIANG Jingping2??? CHEN Guanming1

（1. SanyaNafan Academy of Science and Technology， Sanya， Hainan 572000，China;2. Hainan Rose Valley IndustryDevelopment Co.， Ltd.， Sanya， Hainan 572000， China;3. Sanya Academy of Tropical Agricultural Sciences，Sanya， Hainan 572000， China）

Abstract?? An attempt was made to establish a rapid propagation system for Rosa Fenshan. The stem section of Rosa Fenshan with axillary buds were collected as explants to determine optimum methods for sterilization， induction of shoot cluster， pro- liferation of shoot cluster， test tube rooting， hardening off and transplanting. The results showed that the optimal method for sterilization of the explants is to sterilize the explants with 75% alcohol for 1 min +0.1% HgCl2 for 15min and then add 1 mL·L–1 of Shannong No.1 to the medium， under which the contamination rate is 12% and the survival rate is 74%. The best medium for induction of shoot cluster is WPM +6-BA 0.5 mg·L–1+IBA 0.05 mg·L–1 + Shannong No. 1（type for explant）1 mL·L–1， under which the average number of shoots is upto 2.06， and the shoot induction rate is 96%. The induced clumps of shoots were inoculated on the subculture medium for induction of multiple shoots. The best subculture medium is WPM +6-BA 2.0 mg·L–1+ NAA 0.1 mg·L–1+ GA3 2.0 mg·L–1， under which the multiplication coefficient is as high as 4.10 after 45

days of subculture， and the shoot induction rate is 100%. The shoots were cut from the shoot clumps into individuals， inocu-

lated on the rooting mediums and cultured for 60 days. The best rooting medium is WPM + NAA0.5 mg·L–1， under which the

rooting rate is as higher as 100% with an average root number of 5.0. The rooted plantlets were transferred to culture in a

shade shed for hardening off， and their survival rate is 90% after 7 days of hardening off. After 30 days of hardening off in the

shade shed they are transplanted to the field and their survival rate is 75% after 45 days of transplanting. A rapid in vitro

propagation system is hence initially established for Rosa Fenshan， which might help solve the problem of its rejuvenation and propagation in Sanya， and provide theoretical and technical supports for the rapid propagation of Rosa ‘Fenshan’ and the con- servation of germplasm resources ofRosaFenshan.

Keywords? RosaFenshan; fast propagation in vitro; induction of shoot clusters; rooting

月季粉扇（ Rosa fenshan）母本為 Rosa Hiogi，是1999 年南陽月季基地在緋扇月季中發(fā)現(xiàn)的芽變品種[1]?；ǚ凵咝木磉?，香型，花朵大、上花率高、單朵花開時間長、適栽范圍廣，屬名貴月季品種[2]。粉扇月季抗白粉病、黑斑病能力很強，屬中抗品種，36℃左右的高溫對粉扇月季開花略有影響[3]，是一個較耐高溫的觀賞品種。三亞亞龍灣國際玫瑰谷從云南省花卉技術(shù)培訓推廣中心引種馴化，在園區(qū)進行示范種植。因園區(qū)長期種植月季，加上三亞高溫季節(jié)易旱，雨季易澇[4]，土傳病害泛濫，品種退化嚴重，故選擇生長健壯無病蟲害的粉扇芽點開展離體快繁研究，進行種苗更新?lián)Q代?，F(xiàn)代月季的再生受基因型的影響很大，不同的品種在愈傷誘導、胚狀體及芽器官等的發(fā)生方面差異很大，且只有少數(shù)的品種能獲得相對高頻率的再生植株。影響月季離體快速繁殖的因素不是單一的，主要影響因素有外植體的選擇與滅菌、組培各階段中的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件選擇等[5]。目前國內(nèi)對月季離體快繁的研究報道很多，如紅雙喜月季[6]和芳純月季[7]等。但月季粉扇的離體快繁技術(shù)還未見報道。本研究開展了月季粉扇的外植體消毒、初代培養(yǎng)、叢生芽增殖、生根壯苗及煉苗移栽，建立了月季粉扇離體快繁技術(shù)體系。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實驗所用材料為粉扇健壯帶芽點無病蟲害枝條（芽點未抽出），2018年 12月采自三亞市亞龍灣國際玫瑰谷月季種質(zhì)資源圃。其中山農(nóng)1 號外植體型消毒液購于濟南普朗特生物科技有限公司，用于外植體消毒。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗設(shè)計在連續(xù)晴朗3 天以上的上午10點取外植體材料，人工去掉葉片及雜質(zhì)，剪成1 個芽的莖段，自來水下流水沖洗2 h，加洗潔精搖晃沖洗3 次;然后放入超凈工作臺，用無菌水沖洗

1次，按照8 個不同處理（表1 ）進行消毒和接種?；A(chǔ)培養(yǎng)基為 WPM 培養(yǎng)基，不添加任何激素。每個處理接種30個外植體，3 次重復，接種14 d 后統(tǒng)計污染率及成活率。成活率是指未污染且發(fā)芽的數(shù)量占接種外植體數(shù)量的百分比。

1.2.2? 啟動培養(yǎng)啟動培養(yǎng)基設(shè)6 種（表2 ）： FQ1、FQ2、FQ3、FQ4、FQ5、FQ6，每個處理都添加山農(nóng)1 號（外植體型）1 mL/L，將帶一個飽滿芽點的粉扇莖段接種后培養(yǎng)30 d 統(tǒng)計叢生芽誘導率及平均誘導芽數(shù)。每個處理15個外植體，3 次重復。

1.2.3? 繼代增殖繼代增殖設(shè)置8 個處理： CK 、 FZ1、FZ2、FZ3、FZ4、FZ5、FZ6、FZ7（表3 ），每種培養(yǎng)基接種15個叢生芽，3 次重復。將啟動培養(yǎng)獲得的健康芽點分離切割成大小一致的單個芽點繼續(xù)進行叢生芽增殖培養(yǎng)，45 d 后統(tǒng)計增殖系數(shù)和誘芽率。

1.2.4? 生根壯苗培養(yǎng)選取增殖獲得的健壯的大小一致的月季粉扇的芽點，以 WPM 作為基本培養(yǎng)基，選用 NAA 、6-BA 、GA3這 3種激素。3 個激素取3 水平設(shè)計組成9 組不同的配方，其中 A（NAA 0.5、1.0、1.5 mg/L）; B（6-BA 0、0.05、0.1 mg/L）; C（ GA30 、1、2 mg/L）。每組接種15棵，3 次重復。接種后觀察生根時間，60 d 后統(tǒng)計生根率及平均根數(shù)。找出適于月季粉扇組培苗生根壯苗的配方。

1.2.5? 粉扇的煉苗移栽與苗圃管理

1.2.5.1? 煉苗移栽將生長到6～8 cm 的粉扇生根瓶苗移到有遮陰網(wǎng)的大棚里放置5 d，然后打開蓋子再放置2～3 d，出瓶時，洗凈根部培養(yǎng)基，用1 000倍的多菌靈浸泡15 min，晾干藥液，移栽到提前消毒的基質(zhì)（河沙∶菜園土∶珍珠巖=1∶3∶ 1，體積比）里。

1.2.5.2? 苗圃管理移栽后3 d 左右可噴施1 次1 000倍的多菌靈及低濃度的 NEB;放在通風涼爽的遮陰棚里，3～4 d 噴1 次水，7 d 施1 次葉面肥;30 d 后可搬到大田。

1.2.5.3? 月季粉扇煉苗移栽后的田間管理粉扇組培苗煉苗移栽后30 d 可以轉(zhuǎn)移到大田。澆水要遵循見干見濕，不干不澆，澆則澆透的原則。施肥要遵循少量、多次為原則。一般采用充分腐熟的有機肥為主，追施復合肥相結(jié)合的方式;病害以白粉病、黑斑病、枯枝病為主，可在發(fā)病初期使用500～750倍多菌靈或代森錳鋅噴霧，5～7 d 1次，連續(xù)2～3次;蟲害以蛾類幼蟲、薊馬、螨蟲為主，采用1 500倍多角體病毒噴霧防治蛾類幼蟲，1 000倍吡蟲啉溶液噴霧防治薊馬，1 500倍噠螨靈溶液噴霧防治螨蟲，間隔7～10 d 1次，連續(xù)2～3次。

1.2.6? 統(tǒng)計分析試驗所得數(shù)據(jù)選用 SPSS 19.0和 Excel 2003軟件進行分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對月季粉扇成活率的影響

由表4 可以看出，隨著75%酒精消毒時間的增加，污染率降低，成活率也隨之降低，影響芽的生長，最佳的酒精消毒時間為1 min 。0.1%的 HgCl2消毒10和 15 min 對成活率和污染率影響差異不是很明顯。而培養(yǎng)基里添加山農(nóng)1 號（外植體型）能明顯降低污染率，但濃度不宜過大，最適宜的濃度為1 mL/L。用75%的酒精消毒1 min、0.1%的 HgCl2消毒10 min，培養(yǎng)基中添加山農(nóng)1? 號1 mL/L （處理5 ），外植體消毒效果最好，成活率可達80%，污染率為18%;75%的酒精消毒 1 min、0.1%的 HgCl2消毒15 min，培養(yǎng)基中添加山農(nóng)1 號1 mL/L （處理6 ），成活率可達74%，污染率為12%。處理5 與6 成活率顯著高于其他組。

2.2? 月季粉扇的叢生芽誘導

外植體接種到啟動培養(yǎng)基上10 d 左右開始萌發(fā)新芽，最遲14 d 開始萌動。從表5 可以看出，隨著6-BA 濃度的增加，平均芽數(shù)出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在6-BA 濃度為0.5 mg/L 時達到最大。從 FQ3和 FQ4可以看出，相對于 IBA 和 NAA 而言，添加 IBA 粉扇（FQ5）誘芽率顯著高于添加 NAA 的FQ4，添加 NAA 的配方，培養(yǎng)周期超過 40 d 就會出現(xiàn)新誘導的芽點慢慢死亡的現(xiàn)象。從誘導的平均芽數(shù)來看， FQ3明顯優(yōu)于其他處理，平均萌芽數(shù)可達2.06，誘芽率為96%。

2.3? 月季粉扇的叢生芽繼代增殖

由表6 可以看出，添加一定的激素對月季粉扇有明顯的增殖效果。從 FZ1和 FZ4可以看出，在添加 NAA 和 GA3濃度相同的情況下（ FZ1、 FZ4），增殖系數(shù)隨著6-BA 濃度的增加而提高， 6-BA 濃度為1.0 mg/L 時（ FZ1），會產(chǎn)生生根現(xiàn)象;由 FZ5和 FZ6可以看出，在添加相同濃度6-BA和 AC 的情況下，增值系數(shù)和誘芽率隨著 IBA 濃度的增大而增大;從 FZ7 可以看出，添加 TDZ 會產(chǎn)生大量的愈傷，但發(fā)出的新芽細弱，容易發(fā)黃;從生長情況看，未添加 GA3的處理愈傷容易玻璃化，甚至死亡，出芽率極低。從方差分析可以看出，配方 WPM+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+ GA32.0 mg/L（ FZ3）明顯優(yōu)于其他處理，出芽快，增值系數(shù)可達4.10，誘芽率為100%。14 d 左右產(chǎn)生愈傷，21 d 發(fā)新芽，45 d 左右增殖系數(shù)達到最大，然后會出現(xiàn)黃葉現(xiàn)象。60 d 以上部分處理可以長到7 cm 左右，6～7個節(jié)，并開始出現(xiàn)黃葉現(xiàn)象。

2.4? 月季粉扇的生根壯苗

從表7 可以看出，處理1 和處理7 隨著 NAA 濃度的增大生根率和平均根數(shù)都有所下降，從平均根數(shù)來說，處理1 明顯優(yōu)于其他8 個處理;從處理2 、3、4可以看出，添加低濃度的 NAA 與 GA3配合時可產(chǎn)生大量愈傷，月季粉扇不生根， GA3配合高濃度的 NAA 使用時，產(chǎn)生愈傷，但少量生根;不添加 GA3的處理1 、5、7都沒有愈傷，根系也較健康。方差分析結(jié)果表明，添加 NAA 0.5 mg/L 的處理月季粉扇生根效果明顯優(yōu)于其他處理，平均根數(shù)可達5.0，100%生根，根系健壯，白色。

月季粉扇生根壯苗的培養(yǎng)過程中還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)室的溫度不能過高，局部28℃及以上溫度超過6 h 以上，粉扇的根系就會從白色慢慢變成黑色，并且停止生長，高溫時間過長還會出現(xiàn)黃葉現(xiàn)象。高溫造成的停止生長現(xiàn)象恢復極慢，發(fā)黑的根系不會再生長，恢復后只能重新萌發(fā)新根。

月季粉扇各時期的離體快繁情況見圖1。

2.5? 煉苗移栽及田間管理

月季粉扇組培苗移栽到大棚后，在三亞冬季7 d 成活率為90%左右，30 d 移栽到大田后的成活率為75%左右;在三亞雨季7 d 成活率為80%左右，30 d 移栽到大田后的成活率為60%左右。一般移栽后7 d 左右會發(fā)出新芽，沒有發(fā)出新芽的會枯萎死亡。

3? 討論與結(jié)論

外植體的消毒是建立月季粉扇離體快繁技術(shù)體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。月季粉扇對75%的酒精處理比較敏感，時間過長，死亡率會明顯上升，對 0.1%的 HgCl2反應(yīng)較遲鈍，處理10和 15 min 對死亡率影響不大。閆海霞等[8]研究表明，月季卡羅拉最佳的消毒方案是75%的酒精消毒30 s ，0.1%的 HgCl2消毒10 min，污染率為0;李坤峰等[9]報道月季Vendela外植體最佳消毒處理方式是用洗潔精溶液浸泡30 min，然后用75%的酒精處理40 s ，最后用0.1%的 HgCl2消毒處理10 min 。上述消毒方法與月季粉扇有所差異，本研究表明，無論是哪種處理污染率都沒有達到0，消毒最佳的處理也與上述月季有所不同，這可能是因為三亞地處熱帶，高溫高濕時間較長，外植體材料所含微生物種類較多所致，也有可能是取外植體的季節(jié)不同導致的差異，具體原因還有待進一步探索。

關(guān)于抑菌劑在組培中應(yīng)用的報到很多，王鋒等[10]在進行蛇足石杉組培初代培養(yǎng)時添加了0.05%山農(nóng)1 號。因粉扇外植體的取材地在三亞，污染率一直較高，故本試驗在外植體消毒的啟動培養(yǎng)中開展了山農(nóng)1 號較適濃度試驗。試驗結(jié)果表明，適量添加抑菌劑山農(nóng)1 號（外植體型）能有效降低污染率，增大成活率，最佳濃度為1 mL/L。

外植體的萌動受到啟動培養(yǎng)基成分的影響。劉小夫[11]報道稱，豐花月季5 個品系叢生芽最適合的誘導培養(yǎng)基為 MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA2.0 mg/L，誘導率可以達到91.33%～95.56%。劉子平等[6]指出，紅雙喜最適初代誘導培養(yǎng)基為 MS+6-BA 3.00 mg/L + NAA 0.30 mg/L，誘導率可達到95.56%。筆者在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，對于月季粉扇而言，在配合6-BA 使用時，添加 IBA 培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于 NAA，添加 NAA 的配方，培養(yǎng)周期超過 40 d 就會出現(xiàn)新誘導的芽點慢慢死亡的現(xiàn)象，本研究結(jié)果與以上學者的結(jié)論有所差異，可能不同品種間有所差異。

叢生芽的增殖是組培快繁的重要階段之一。筆者發(fā)現(xiàn)，增殖過程中形成的愈傷如果玻璃化則出芽率就會極低，芽細弱，容易死亡;而添加 GA3的處理，玻璃化會降低，形成的愈傷較少，增殖出的芽較健壯，這與沙琳[12]的研究結(jié)果相似。

本研究關(guān)于月季粉扇的生根正交試驗結(jié)果表明，最佳生根培養(yǎng)基為 WPM+0.5 mg/L NAA，平均生根數(shù)可達5 條，生根率100%，優(yōu)于梁崢等[13]? 研究結(jié)果。在生根培養(yǎng)過程中，溫度也是重要影響因素。月季粉扇在生根過程中對溫度比較敏感，溫度稍微變高，長出來的白色根系就會發(fā)黑，停止生長。周慶華等[14]報道指出，月季在生根培養(yǎng)過程中對溫度的變化十分敏感，在 21℃時，生根效果最好，這與本試驗研究過程中觀察到的現(xiàn)象相似。不同月季的品種培養(yǎng)溫度不同，是否與月季的耐熱性有關(guān)還有待進一步研究。

綜上，該研究建立了月季粉扇離體快繁技術(shù)體系，為月季粉扇的規(guī)模化繁殖提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。研究結(jié)果表明，月季粉扇最佳的消毒方案為75%的酒精消毒1 min，0.1%的 HgCl2消毒15 min，培養(yǎng)基中添加山農(nóng)1 號1 mL/L;叢芽誘導培養(yǎng)基為 WPM+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+山農(nóng)1 號（外植體型）1 mL/L;最佳繼代增殖配方為 WPM+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+GA3 2.0 mg/L;生根效果最好的配方為 WPM+NAA 0.5 mg/L。

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（責任編輯龍婭麗）