EBV DNA 檢測結(jié)合Th17、Treg 細胞在小兒EB病毒感染診斷中的應(yīng)用意義

陳智勇，成勝

鹽城市第三人民醫(yī)院兒科（南京醫(yī)科大學(xué)鹽城臨床醫(yī)學(xué)院），江蘇鹽城 224000

EB 病毒（epstein-barr virus, EBV）是兒科常見的感染性病毒，其傳播途徑廣，包括唾液、血液、器官移植等，該病毒具備普遍性、終生潛伏性，難以通過免疫系統(tǒng)進行清除[1-2]。有研究表明，EB 病毒無癥狀感染多見于幼兒，與鼻咽癌、兒童淋巴瘤疾病發(fā)生關(guān)系密切[3]。EBV DNA 是檢測EB 病毒感染的主要方法，EBV DNA 陽性是其感染最直接證據(jù)，但當患者處于恢復(fù)期或潛伏感染期，EBV DNA 水平下降，或直接檢測為陰性[4-5]。另外EBV DNA 檢測方法復(fù)雜、成本較高，且當處于潛伏期或緩解期時，會限制其EB 病毒感染的檢測[6]。由于自身免疫性疾病常伴免疫系統(tǒng)失衡的問題，輔助性T 細胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）失衡是致自身免疫性疾病發(fā)生的重要機制[7]。但對EB 病毒的免疫特點缺乏系統(tǒng)性研究，且關(guān)于EB 病毒感染疾病的免疫學(xué)研究的相關(guān)報道較少。為了能提高EB 病毒感染檢測率，本文選取2020 年1 月—2022 年6 月鹽城市第三人民醫(yī)院兒科收治的50 例EB 病毒感染患兒及同期健康體檢兒童50 名作為研究對象，對兩組研究對象采用EBV DNA 結(jié)合Th17、Treg 細胞檢測，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院兒科收治的EB 病毒感染患兒50 例為觀察組，同期健康體檢兒童50 名為對照組。觀察組中男28 例，女22 例；年齡1～14 歲，平均（6.51±1.02）歲。對照組中男25 名，女25 名；年齡1～14 歲，平均（6.48±1.05）歲。兩組患兒一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 納入及排除標準

納入標準：從血清學(xué)抗體、骨髓、淋巴結(jié)組織等檢測出EB 病毒陽性，符合EB 病毒感染標準[8]；病歷資料完整；入院前未采用抗感染治療；參與研究對象的家長或法定監(jiān)護人知情同意，并已簽署同意書。

排除標準：伴免疫性疾病或感染性疾病患兒；伴其他病毒感染患兒；近期經(jīng)免疫抑制劑或激素類藥物治療患兒；腫瘤性疾病者患兒。

1.3 方法

兩組對象均采集空腹靜脈血5 mL，分成3 份，分別為1、2、2 mL；EBV DNA 測定：將1 mL 樣本添加淋巴細胞1 mL，離心20 min，2 000 r/min，留取中間白色云霧狀細胞層，采用熒光定量PCR 法檢測，先將細胞層離心5 min，12 000 r/min，留取沉淀物后添加DNA 提取液50 μL，混勻離心10 min，100℃，留取上層清液備用。隨后采用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）擴增反應(yīng)處理，條件：93℃，2 min；93℃，45 s；55℃，60 s，總循環(huán)10 次。隨后93℃，30 s；55℃，45 s，總循環(huán)45 次。反應(yīng)后保存數(shù)據(jù)，調(diào)節(jié)熒光值，讀取結(jié)果，計算待測標本病毒拷貝數(shù)，以5×102copies/μL 為臨界值，若超過則為陽性。Th17、Treg 細胞：采用流式細胞術(shù)測定，Th17 細胞：經(jīng)密度梯度離心法獲取單一核細胞，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h，37℃，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline, PBS）洗滌后，丟棄上清液，用FACS CantoⅡ流式細胞儀測定；Treg 細胞：將血清樣本加入單克隆抗體后，暗室孵育20 min，添加溶血素1 mL，混勻，離心5 min，1 500 r/min，用FACS CantoⅡ流式細胞儀測定。

1.4 觀察指標

①比較觀察組和對照組患者EBV DNA 陽性率；②比較觀察組和對照組患者EBV DNA、外周血輔助性T 細胞17（T-helper cells, Th17）、調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells, Treg）水平；③比較觀察組中初治組與緩解組EBV DNA 水平外周血Treg 細胞及Th17 細胞百分率水平。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間差異比較進行t檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間差異比較進行χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組組EBV DNA 陽性率比較

觀察組EBV DNA 陽性率為88.00%高于對照組的0.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 觀察組和對照組EBV DNA 陽性率比較[n(%)]

2.2 觀察組和對照組EBV DNA、Treg 細胞及Th17細胞水平比較

觀察組EBV DNA 含量、Th17 細胞水平均高于對照組，外周血Treg 細胞低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 觀察組和對照組EBV DNA、Treg 細胞及Th17 細胞水平比較(±s)

表2 觀察組和對照組EBV DNA、Treg 細胞及Th17 細胞水平比較(±s)

2.3 初始組和緩解組EBV DNA、Treg 細胞及Th17細胞百分率水平比較

50 例EB 病毒感染患兒分為初治組16 例，緩解組34 例，初治組EBV DNA 含量、Th17 細胞水平均高于緩解組，外周血Treg 細胞低于緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 初始組和緩解組EBV DNA、Treg 細胞及Th17 細胞百分率水平比較(±s)

表3 初始組和緩解組EBV DNA、Treg 細胞及Th17 細胞百分率水平比較(±s)

3 討論

EB 病毒屬雙鏈DNA 病毒，是傳染性單核細胞增多癥的病原體，并會誘發(fā)鼻咽癌、淋巴瘤等，被證實為可能致癌的人類腫瘤病毒之一[9-10]。EB 病毒感染分為增殖性或潛伏期感染，一旦誘發(fā)慢性活動性EB 病毒感染，或相關(guān)噬血淋巴組織細胞增生癥，病情危重，預(yù)后不佳[11-12]。EBV DNA 是檢測EB 病毒感染的理想方法，自PCR 技術(shù)用于各種病毒抗原檢測，明顯提高EBV DNA 檢測獲取率[13]。本研究中觀察組EBV DNA 陽性率88.00%高于對照組的0.00%，EBV DNA 含量高于對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，EB 病毒感染者存在EBV DNA 含量升高情況，李海霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)傳染性單核細胞增多癥患兒EBV DNA 陽性率85.71% 高于健康兒童的3.33%（P＜0.05）。說明根據(jù)EBV DNA 陽性檢出情況，對判斷EB 病毒感染有重要意義。雖然EBV DNA 檢測意義較高，但若患兒免疫低下，或使用免疫抑制劑治療，或病情處于疾病緩解期時，EBV DNA 處于正常，難以獲得理想結(jié)果。本組研究，初治組EBV DNA 含量高于緩解組（P＜0.05），本研究結(jié)果論證了上述研究理論，故需要結(jié)合其他指標共同檢測。

有研究指出，兒童呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，當感染EB 病毒后，極易導(dǎo)致外周血淋巴細胞異常改變[15]。同時病毒感染會釋放不同抗原，而此類抗原所產(chǎn)生的抗體起到不同程度的免疫保護機制[16]。Treg 細胞具備免疫調(diào)節(jié)功能，維持著機體免疫耐受、抑制自身免疫反應(yīng)的作用。Th17 細胞可以分泌白細胞介素-17（interleukin-17, IL-17）具有抑制病毒微生物侵襲作用之外，也可以促進慢性炎癥反應(yīng)[17]。本研究中，觀察組外周血Treg 細胞低于對照組，Th17 細胞水平高于對照組，初治組外周血Treg 細胞低于緩解組，Th17 細胞水平高于緩解組（P＜0.05）。結(jié)果說明，EB 病毒感染患兒存在免疫失衡狀態(tài)，而在緩解期，患兒免疫狀態(tài)逐漸改善。周洋等[18]研究顯示EB 病毒感染患兒存在Treg 細胞減少，Th17 細胞增加現(xiàn)象，在EB 病毒感染的相關(guān)疾病發(fā)生過程中扮演著重要的角色。分析其原因可能是EB 病毒感染，與EB 病毒靶細胞相關(guān)的T 淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell, NK）等功能缺陷，影響EB 病毒清除過程，甚至?xí)龠MTh17 細胞分化及發(fā)育，使Th17 細胞含量升高，并會出現(xiàn)炎癥級別擴大效應(yīng)，抑制Treg 細胞產(chǎn)生，造成T 淋巴細胞過度活化，從而導(dǎo)致患兒免疫功能障礙。同時當EB 病毒處于裂解期或潛伏期時，特異性毒T 淋巴細胞不斷增殖及凋亡，少數(shù)免疫抗原隱藏于體內(nèi)，并在血液內(nèi)不斷循環(huán)，若EB 病毒再次增殖，隱藏的免疫抗原會迅速活化，并產(chǎn)生極為明顯的免疫應(yīng)答，致免疫障礙。

綜上所述，EB 病毒感染患兒存在EBV DNA 陽性率增加、Th17 細胞升高、Treg 細胞下降情況。因此，采用EBV DNA 結(jié)合Th17、Treg 細胞對小兒EB病毒感染診斷及病情評估中具有積極意義。