STIM1 基因在人下咽癌細胞系FaDu 中的表達及對細胞凋亡的影響分析

孫源昊，李文龍，代兵，于慧媛，常江

深圳市薩米醫(yī)療中心，廣東深圳 518118

下咽癌是原發(fā)于下咽部的惡性腫瘤，其形成于喉嚨底部組織，且95%以上為鱗狀細胞癌，患病部位從高到低依次為梨狀窩、環(huán)后區(qū)、咽后壁3 處[1]。國外調查數據顯示，美國每年3 000 人被確診為下咽癌，男性患病率為女性患病率的5 倍，且患病早期無明顯癥狀，隨病情加重患者咽喉部出現聲嘶、頸部腫塊、貧血、消瘦等臨床表現，腫瘤侵犯頸部血管還可造成嚴重病質表現，影響患者生存質量[2-3]。鈣離子通路與癌癥關系密切，相關研究證實，通過抑制鈣離子可促使癌細胞生長停滯并誘導細胞凋亡，而調控細胞質內鈣離子的整個過程被稱為內質網鈣庫調控的胞外鈣離子內流進程（store-operated calcium entry, SOCE）[4-5]。STIM1 基因是SOCE 輸入過程中的關鍵基質，對癌癥細胞調控生長生存尤為重要，相關研究表明STIM1 是致癌基因，其在食管癌、宮頸癌中高表達[6-7]。但當前尚無確切研究證實STIM1 在下咽癌中表達情況及生物學水平變化?；诖耍疚倪x取2020 年3 月—2022 年3 月期間深圳市薩米醫(yī)療中心耳鼻咽喉科收取的40 份咽癌患者細胞作為培養(yǎng)對象，著重分析STIM1 在人下咽癌FaDu 細胞中的表達及凋亡情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于本院就診的40 份下咽癌患者細胞作為培養(yǎng)對象，通過培養(yǎng)人下咽癌細胞系FaDu 細胞，分為兩組，各20 份。

1.2 診斷標準

經常規(guī)X 線檢查后梨狀窩密度增高、椎前軟組織明混增厚，氣管推向前，聲帶及室?guī)ё冃巍?/p>

1.3 納入與排除標準

納入標準：①培養(yǎng)對象符合下咽癌診斷標準；②研究對象細胞符合《2016 英國國家多學科指南：下咽癌》診斷標準[8]；③培養(yǎng)基符合《中國藥典》2010版和《哺乳類動物細胞培養(yǎng)基》（HG/T 3935-2007）標準[9]。

排除標準：①培養(yǎng)對象資料不完整；②細菌數＜200；③細胞數量培養(yǎng)72 h 后低于1×108cells/mL；④細胞形態(tài)變異。

1.4 方法

①培養(yǎng)基：首先進行細胞培養(yǎng)，選取定量培養(yǎng)基，通過液氮對下咽癌FaDu 細胞進行迅速解凍，并在離心后去上層清液，將培養(yǎng)液放入含有青鏈霉素和胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37℃、5% 二氧化碳中。

②慢病毒感染：對生長發(fā)育的細胞混懸液進行慢病毒感染，將生成混懸液置入6 孔板內，放置于37℃、5%的二氧化碳中，直至細胞融合度＞30%，根據細胞原始數據適當添加病毒，12 h 后觀察評估細胞狀態(tài)，若細胞未出現明顯毒性作用，需進行二次培養(yǎng)，時間延長至24 h 后更換培養(yǎng)基，若細胞出現毒性作用，應及時更換培養(yǎng)基，感染3 d 后觀察培養(yǎng)基基因表達情況，細胞感染后進行詳細記錄。

③細胞增殖：對照組為常規(guī)空白組，添加適量BrdU，且實驗時無須加入，檢測前加入試劑，以1:100 比例進行稀釋，稀釋后適量添加試劑進行培養(yǎng)。

④細胞凋亡：采用D-Hanks 對細胞進行單次沖洗，并對細胞進行胰酶消化，培養(yǎng)上清終止消化，收集細胞后存于離心管內，各組設定3 個復孔，采用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）進行沖洗沉淀離心，離心后收集細胞，添加5μl annexin V-APC 染色，基于常規(guī)溫度下避開陽光照射，10 min 后轉移到流式上機管中，進行測驗。

⑤細胞周期：細胞發(fā)育到80%時吸附舍棄細胞培養(yǎng)上清，并對細胞進行沖洗，經胰酶消化細胞后停止培養(yǎng)，并將細胞放置于離心管內設置復孔，離心后舍棄上清并應用乙醇進行細胞固定，固定后離心處理固定液，對細胞再次進行沖洗沉淀，確保上機細胞通過率達到240 cell/s，將300 目細胞過濾篩網轉移至上機管內進行上機測試。

⑥細胞蛋白水平：對兩組培養(yǎng)基加入提前預冷的裂解液，在冰上裂解30 min，裂解后用超聲破碎細胞，4℃ 12 000 r/min 低溫高速離心15 min，棄沉淀，取上清，應用Western blot 相關總蛋白分析試劑測量562 nm 處的吸光度，并作蛋白標準物的吸光度-濃度曲線，對測得結果進行比較。

1.5 觀察指標

比較兩組病毒感染后蛋白水平表達及細胞凋亡、增殖、生長能力情況。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件處理數據，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間差異比較進行t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞蛋白水平表達比較

STIM1 組蛋白水平表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組細胞蛋白水平表達對比(±s)

表1 兩組細胞蛋白水平表達對比(±s)

2.2 兩組細胞凋亡、增殖、周期比較

STIM1 組細胞凋亡、增殖情況高于對照組，周期情況低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組細胞凋亡、增殖、周期對比[(±s),%]

表2 兩組細胞凋亡、增殖、周期對比[(±s),%]

2.3 兩組細胞數及細胞增殖倍數比較

STIM1 組細胞數高于對照組，增殖倍數低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組細胞數及細胞增殖倍數對比(±s)

表3 兩組細胞數及細胞增殖倍數對比(±s)

3 討論

人下咽癌在臨床癌癥中發(fā)病率較低，但在頭頸腫瘤發(fā)病率中占據5%，且惡性程度較高，發(fā)病位置較為特殊，70%下咽癌患者確診時已為晚期，治療后預后效果欠佳[10]。國外針對下咽癌以手術和放療為主，早期下咽癌主要以根治性放療治療為主，在治療過程中患者生存率與根治性手術無差異，于20 世紀中期放療是治療下咽癌的主要手段，但隨醫(yī)療技術不斷發(fā)展，手術序貫放療治療出現，但當前多數下咽癌患者就診時已進展至中晚期，需給予手術放療綜合治療[11]。當前國內針對下咽癌治療主要采取綜合治療方式，早期患者可經口微創(chuàng)外科切除或進行頸部清掃，包括對T1N0以及選擇性的T2N0 患者進行保喉手術；對T1～3N0～3 和T4aN0～3 無器官功能保留需要的患者行全喉切除術；對T1～3N0～3 和T4aN0～3 在行誘導化療后原發(fā)灶小于PR 者，行手術治療；對行根治性放化療后殘存或復發(fā)的患者進行手術治療[12]。對于需要保留喉功能的患者，多行手術聯合頸部清掃，并進行放療或靶向治療，針對中晚期患者，多行手術治療聯合術后放療后，但術后患者仍需承受喉功能受損或喉功能喪失的痛苦。相關研究發(fā)現人下咽癌FaDu 細胞中STIM1 基因表達顯著，實驗組凋亡的FaDu 細胞顯著提升，STIM1 基因在FaDu 細胞中顯著表達，且STIM1 蛋白表達同對照組相比明顯受到抑制[13-14]。

細胞凋亡是機體基因調控細胞程序性死亡的主動過程，腫瘤與凋亡關系密切，腫瘤發(fā)生多數為凋亡受阻導致，當腫瘤細胞凋亡能力被抑制，未能正常死亡，致使細胞數量增加[15]。通過體外慢性病毒感染實驗發(fā)現，STIM1 沉默后，FaDu 增殖受到抑制且凋亡情況明顯提升，細胞周期被阻滯，細胞克隆能力降低，生長情況減慢。STIM1 基因位于人類染色體11p15.5 區(qū)域，其編碼蛋白的分子量約為77 KDa，且在真核細胞中鈣離子作為細胞內重要的第二信使，細胞質內鈣濃度改變及許多生理功能變化密切，蛋白質、內質網膜對鈣含量敏感，在細胞靜止時可檢測少量STIM1，同時實驗發(fā)現下咽癌腫瘤細胞明顯受到STIM1 抑制，能影響腫瘤細胞增殖凋亡及周期，進而抑制腫瘤細胞生長。STIM1 組下咽癌FaDu 細胞數量提升，同時STIM1 表達可抑制癌細胞增殖，確保細胞周期停滯。結果顯示：STIM1 基因組細胞蛋白水平表達（0.75±0.23）低于對照組（0.96±0.21）；STIM1 組細胞凋亡、增殖情況高于對照組，周期情況低于對照組；STIM1 組細胞數高于對照組，增殖倍數低于對照組（P＜0.05）。宋殿芳等[16]的研究結果顯示，STIM1 組與空白對照組相比，STIM1-siRNA 組細胞侵襲能力以及PCNA、MMP-2、β-catenin、c-myc 的蛋白表達（0.63±0.15）均顯著降低，同本文結果相似，但本研究主要針對下咽癌進行研究。

綜上所述，STIM1 基因對下咽癌疾病FaDu 誘發(fā)發(fā)展有一定影響，且進一步了解STIM1 與下咽癌臨床癥狀的聯系，可發(fā)現STIM1 對下咽癌治療具有一定價值，下咽癌患病位置較為特殊，術后會影響患者交流、呼吸及生存質量，因此STIM1 相關基因對下咽癌FaDu 細胞基因具有影響作用，可作為下咽癌治療的新切入點。