MiR-181a-5p 通過靶向KLF6 信號調(diào)控低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移的機制研究

陳妮，趙梅

1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院藥學部，海南?？?570311；2.三亞中心醫(yī)院（海南省第三人民醫(yī)院）藥學部，海南三亞 572000

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension, PAH）是一種罕見的疾病，其特征是小肺動脈進行性閉塞，導致肺動脈壓升高和右心衰竭[1-2]。在過去的幾十年中，對該疾病的病理生理學的深入了解導致開發(fā)了針對內(nèi)皮功能障礙的有效療法（依前列醇及其衍生物、內(nèi)皮素受體拮抗劑和5 型磷酸二酯酶抑制劑）[3]。這些藥物可以改善臨床、功能和血流動力學。盡管如此，PAH 尚無治愈方法，預后仍然很差。MicroRNAs（miRNAs, miRs）是一類內(nèi)源性的小型非編碼RNA，其通過靶向mRNA 的3'-非翻譯區(qū)（3’-untranslated region, UTR）來負調(diào)控基因表達，以進行基因降解或翻譯抑制[4]。miRNA 具有多種細胞功能，包括調(diào)節(jié)細胞代謝、發(fā)育、增殖和死亡。研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA 在PAH 的病理生理中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 能夠通過抑制炎癥反應來緩解大鼠的肺動脈癥狀，提示miR-181a-5p 在PAH 的病理生理中起到關(guān)鍵的作用[6]。然而miR-181a-5p 調(diào)控PAH，特別是調(diào)控肺動脈血管平滑肌細胞增殖、遷移等分子機制尚未明確。因此，本研究2021 年11 月—2022 年5月進行，探討了miR-181a-5p 對肺動脈血管平滑肌細胞增殖以及遷移的影響，并探索了相應的分子調(diào)控通路。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

DMEM 培 養(yǎng) 基、FBS 胎 牛 血 清、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；肺動脈平滑肌細胞購于美國ATCC 公司；miR-181a-5p 模擬 物，模擬物對照，miR-181a-5p 抑制劑，抑制劑對照，pcDNA3.1 以及pcDNA3.1-KLF6 購于廣州銳博生物科技有限公司；螢光素酶報告載體以及螢光素酶檢測試劑盒購于美國Promega 公司；CCK-8 檢測試劑盒購于北京碧云天生物科技有限公司。實時定量PCR 試劑盒以及Trizol 試劑購于日本Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將肺動脈平滑肌細胞用含10%胎牛血清的不含抗生素的DMEM 培養(yǎng)基懸浮后,置于條件為37℃、5%的CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在鏡下觀察細胞生長情況,并根據(jù)情況進行換液,當細胞融合度達80%以上時可進行消化傳代。取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染當肺動脈平滑肌細胞細胞貼壁后，使用Lipofeetamine 2000 試劑根據(jù)使用說明對細胞進行相應的質(zhì)粒和miRNA 進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h，進行相關(guān)的試驗。

1.2.3 處理分組第1 組實驗細胞分別用常氧（21%O2和5%CO2）或 者 低 氧（3%O2、5%CO2和92%N2），分別處理12、24 h 或者48 h 后，收集細胞進行相關(guān)實驗；第2 組實驗：細胞分別用常氧（21%O2和5%CO2）、低氧（3%O2、5%CO2和92%N2）或者低氧（3%O2、5%CO2和92%N2）聯(lián)合miR-181a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染處理人肺動脈平滑肌細胞，24 h 后,收集細胞進行相關(guān)實驗。第3 組實驗：人肺動脈平滑肌細胞利用miR-181a-5p 抑制劑或者抑制劑對照轉(zhuǎn)染，24 h 后,收集細胞進行相關(guān)實驗。第4 組實驗：細胞分別用低氧（3%O2、5%CO2和92%N2）、低氧（3%O2、5%CO2和92%N2）聯(lián)合miR-181a-5p 模擬物轉(zhuǎn) 染、低 氧（3%O2、5%CO2和92%N2）聯(lián) 合miR-181a-5p 模擬物以及pcDNA3.1-KLF6 處理人肺動脈平滑肌細胞，24 h 后,收集細胞進行相關(guān)實驗。

1.2.4 實時定量PCR使用Trizol 試劑盒從細胞系中分離出包括miRNA 的總RNA。分別使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PrimeScript RT 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR 預混Ex Taq 在ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng) 上進行實時熒光定量PCR。U6 作為miR-181a-5p 的表達內(nèi)參，GAPDH 作為PCNA 的內(nèi)參；用2-ΔΔCt法計算相關(guān)基因的相對表達水平。

1.2.5 CCK-8 試驗使用CCK-8 檢測試劑盒檢測細胞活性。收集經(jīng)過不同處理的細胞，以每孔1×103 個細胞的密度接種到96 孔板中，24 h 后，將CCK-8 溶液加入各孔中，于37℃下孵育2 h，450 nm 處測定吸光度，計算細胞活性。

1.2.6 雙熒光素酶試驗采用TargetScan 預測發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p 和KLF6 3'-UTR 有連續(xù)的結(jié)合位點。按照說明書將KLF6 3‘UTR 野生型或突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體和模擬物對照或者miR-181a-5p 模擬物分別或同時轉(zhuǎn)入肺動脈平滑肌細胞。培養(yǎng)48 h 后小心吸棄培養(yǎng)液,洗滌細胞后加入細胞裂解液裂解細胞5～10 min，3 000 r/min 離心5 min，取上清，利用雙熒光素酶報道試劑盒對熒光素酶活性進行測定。

1.3 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Bonferroni's 校正檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧誘導增強肺動脈平滑肌細胞的活性，下調(diào)肺動脈平滑肌細胞中的miR-181a-5p 相對表達水平

CCK-8 結(jié)果顯示，低氧處理肺動脈平滑肌細胞0 h 組（100.00±15.10），12 h 組（110.3±10.1），12 h 后未增強肺動脈平滑肌細胞的活性，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.985，P＞0.05），見 圖1A。 0 h 組（100.00±15.10），24 h（145.7±10.2），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.353，P＜0.05）；0 h 組（100.00±15.10），48 h 組（147.7±15.3），差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（t=4.545，P＜0.05），24、48 h 低氧處理能夠增加肺動脈平滑肌細胞的活性，見圖1A。實時定量PCR 檢測結(jié)果顯示，0 h 組（1.00±0.06），12 h 組（0.87±0.053），差異無統(tǒng)計學意義（t=1.561，P＞0.05），12 h 低氧處理對肺動脈平滑肌細胞中miR-181a-5p 的相對表達水平未影響，見圖1B。0 h 組（1.00±0.06），24 h 組（0.49±0.15），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.545，P＜0.001）；0 h 組（1.00±0.06），48 h 組（0.43±0.12），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.882，P＜0.001），24、48 h 低氧處理能夠顯著下調(diào)肺動脈平滑肌細胞中miR-181a-5p 的相對表達水平，見圖1B。

圖1 低氧誘導增強肺動脈平滑肌細胞的活性，下調(diào)肺動脈平滑肌細胞中的miR-181a-5p 相對表達水平

2.2 miR-181a-5p 過表達抑制低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞活性以及遷移

miR-181a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染后，miR-181a-5p 模擬物組（9.20±1.95），模擬物對照組（1.00±0.12），24 h 能夠顯著提高肺動脈平滑肌細胞中的miR-181a-5p相對表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.282，P＜0.05），見圖2A。低氧 組（154.30±7.60），對照組（100.00±26.10），24 h 低氧處理能夠增強肺動脈平滑肌細胞的活性，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.166，P＜0.05）；上調(diào)PCNA 的表達水平，低氧組（2.06±0.29），對照組（1.00±0.11），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.919，P＜0.05），見圖2B、圖2C。低氧+miR-181a-5p 模擬物組（107.00±5.60），低氧組（154.30±7.60），miR-181a-5p 過表達能夠顯著下調(diào)低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞活性，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.630，P＜0.05），見圖2B。PCNA 的表達水平，低氧+miR-181a-5p 模擬物組（1.33±0.25），低氧組（2.06±0.29），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.929，P＜0.05），見圖2C。進一步的劃痕修 復 試 驗 發(fā) 現(xiàn)，低 氧 組（71.67±6.51），對 照 組（46.67±6.66），24 h 低氧處理能夠促進肺動脈平滑肌細胞的遷移，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.782，P＜0.05），見 圖2D。低 氧+miR-181a-5p 模 擬 物 組（51.67±6.03），低氧組（71.67±6.51），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.825，P＜0.05），miR-181a-5p 過表達能夠顯著下調(diào)低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞遷移能力，見圖2D。

圖2 miR-181a-5p 過表達抑制低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖以及遷移

2.3 miR-181a-5p 敲減促進低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖以及遷移

通過轉(zhuǎn)染試驗，miR-181a-5p 抑制劑組（0.43±0.07），抑制劑對照組（1.00±0.28），miR-181a-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染后24 h 能夠顯著下調(diào)肺動脈平滑肌細胞中的miR-181a-5p 相對表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.410，P＜0.05），見圖3A。CCK-8 試驗檢測，miR-181a-5p 抑制劑組（152.70±10.40），抑制劑對照組（100.00±21.90），miR-181a-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染能夠顯著增強肺動脈平滑肌細胞的活性，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.758，P＜0.05），見圖3B。實時定量PCR 檢測，miR-181a-5p 抑制劑組（1.60±0.12），抑制劑對照組（1.00±0.04），miR-181a-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染能夠顯著上調(diào)肺動脈平滑肌細胞中PCNA 的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.202，P＜0.05），見圖3C。劃痕修復試驗，miR-181a-5p 抑制劑組（68.67±6.81），抑制劑對照組（47.67±8.33），miR-181a-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染能夠顯著增強肺動脈平滑肌細胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.382，P＜0.05），見圖3D。

圖3 miR-181a-5p 敲減促進低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖以及遷移

2.4 MiR-181a-5p 負向調(diào)控肺動脈平滑肌細胞中KLF6 的表達

通過TargetScan 在線生信分析工具，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 與KLF6 3’UTR 區(qū)域存在相互結(jié)合的區(qū)域，見圖4A。通過螢光素酶報告試驗檢測發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p 模 擬 物 組（0.26±0.089）模 擬 物 對 照 組（1.00±0.14），miR-181a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染能夠顯著降低野生型KLF6 3’UTR 螢光素酶報告載體的螢光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.729，P＜0.05），見圖4B。miR-181a-5p 模擬物組（1.04±0.12），模擬物對照組（1.00±0.13），miR-181a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染對突變型KLF6 3’UTR 螢光素酶報告載體的螢光素酶活性沒有影響，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.421，P＞0.05），見圖4C。實時定量PCR 檢測結(jié)果顯示，miR-181a-5p模擬物組（0.36±0.11），模擬物對照組（1.00±0.03），miR-181a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染能夠顯著下調(diào)肺動脈平滑肌細胞中的KLF6 mRNA 表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.439，P＜0.05），見圖4D。低氧組（1.58±0.18），對照組（1.00±0.17），24 h 低氧處理顯著下調(diào)肺動脈平滑肌細胞中的KLF6 mRNA 表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.108，P＜0.05），見圖4E。

圖4 miR-181a-5p 負向調(diào)控肺動脈平滑肌細胞中KLF6 的表達

2.5 KLF6 過表達能夠拮抗miR-181a-5p 對低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移的抑制作用

pcDNA3.1-KLF6 載體轉(zhuǎn)染能夠顯著上調(diào)肺動脈平滑肌細胞中KLF6 mRNA 的表達水平pcDNA3.1-KLF6 組（3.53±1.43），pcDNA3.1 組（1.00±0.17），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.055，P＜0.05），見圖5A。miR-181a-5p 過表達能夠顯著下調(diào)低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞活性，低氧+miR-181a-5p 模擬物組（61.1±4.0），低氧組（100.00±14.50），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.408，P＜0.05），見圖5B；和PCNA 的表達水平，低氧+miR-181a-5p 模擬物組（0.47±0.078），低氧組（1.00±0.12），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.645，P＜0.05），見圖5C,而pcDNA3.1-KLF6 轉(zhuǎn) 染能 夠拮抗miR-181a-5p 過表達對低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞活性，低氧+miR-181a-5p 模擬物+pcDNA3.1-KLF6 組（86.0±2.6），低氧+miR-181a-5p 模擬物組（61.10±4.00），差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（t=3.467，P＜0.05），見圖5B；和PCNA 的表達抑制的影響，低氧+miR-181a-5p 模 擬 物+pcDNA3.1-KLF6 組（0.83±0.081），低氧+miR-181a-5p 模擬物組（0.47±0.078），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.542，P＜0.05），見圖5C。miR-181a-5p 過表達能夠顯著下調(diào)低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞遷移能力，低氧+miR-181a-5p 模擬物組（46.33±4.16），低氧組（70.33±6.11），差異有統(tǒng)計學 意 義（t=4.323，P＜0.05），見 圖5D。pcDNA3.1-KLF6 轉(zhuǎn)染能夠拮抗miR-181a-5p 過表達對低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞遷移抑制的影響，低氧+miR-181a-5p 模擬物+pcDNA3.1-KLF6 組（66.00±9.17），低氧+miR-181a-5p 模擬物組（46.33±4.16），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.543，P＜0.05），見圖5D。

圖5 KLF6 過表達能夠拮抗miR-181a-5p 對低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移的抑制作用

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 在低氧誘導的肺動脈血管平滑肌細胞中表達下調(diào)；進一步的功能試驗發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 過表達能夠部分反轉(zhuǎn)低氧誘導的肺動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移；miR-181a-5p 敲減能夠促進肺動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移。通過進一步的生物信息學預測試驗發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 能夠與KLF6 的3‘UTR 區(qū)域結(jié)合；功能驗證試驗進一步發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 能夠負向調(diào)控KLF6 在肺動脈平滑肌細胞的表達，而低氧誘導能夠上調(diào)KLF6 的表達水平。營救試驗發(fā)現(xiàn)KLF6 過表達能夠反轉(zhuǎn)miR-181a-5p 過表達對低氧誘導的肺動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移的抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 在調(diào)控心血管細胞的生物學功能方面起到非常關(guān)鍵的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖、遷移，同時促進其凋亡，進而調(diào)控粥狀動脈硬化的病理進程[7]。另有研究表明miR-181a-5p 通過靶向PDGFRA 來抑制血管內(nèi)皮細胞的血管生成[8]。Deng L 等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 能夠抑制癌細胞的遷移和血管生成。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p過表達能夠抑制網(wǎng)絡新生血管，其是通過調(diào)控endocan 和ERK1/2 信號通路來實現(xiàn)的[10]。在對肺動脈高壓（pulmonaryarterial hypertension, PAH）的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 通過靶向endocan 改善野百合堿誘導的PAH 的炎癥反應[11]。最新的研究發(fā)現(xiàn)KLF2 誘導的外泌體miR-181a-5p 可以減弱PAH 的血管重塑[12]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導能夠抑制miR-181a-5p 的表達，同時miR-181a-5p 過表達抑制低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖以及遷移，而miR-181a-5p 敲減促進低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖以及遷移。以上這些證據(jù)提示miR-181a-5p可能是通過抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，從而來緩解PAH 的病理進展。

由于miRNA 一般是通過靶向mRNA 的3'UTR來負調(diào)控基因表達，本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 能夠與KLF6 3’UTR 區(qū)域結(jié)合，通過進一步的試驗發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p 能夠負向調(diào)控肺動脈平滑肌細胞中的KLF6 的表達水平。Krüppel 樣因子6（KLF6）是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；它屬于鋅指類DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的Krüppel 樣因子（KLFs）家族，可調(diào)節(jié)包括細胞增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導、腫瘤發(fā)生和細胞死亡在內(nèi)的整體功能。研究發(fā)現(xiàn)KLF6 能夠介導大鼠實驗性肝肺綜合征中的肺血管生成[13]。Kim GD 等[14]發(fā)現(xiàn)KLF6 能夠促進巨噬細胞的炎癥反應和低氧反應。研究也發(fā)現(xiàn)KLF6 信號通路激活參與糖尿病肺纖維化中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)KLF6 過表達能夠反轉(zhuǎn)miR-181a-5p 過表達對低氧誘導的肺動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移的抑制作用。以上這些結(jié)果提示，miR-181a-5p 通過靶向抑制KLF6 的表達，使肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移，緩解PAH 的病理進展。本研究僅僅驗證KLF6 為miR-181a-5p的一個下游靶點，未對其他靶點進行相關(guān)的驗證。因此將來有必要對其他的靶點進行相關(guān)驗證，從而更全面了解miR-181a-5p 在PAH 中的分子調(diào)控機制。

綜上所述，本研究結(jié)果提示miR-181a-5p 能夠抑制低氧誘導下的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移，其作用機制可能是通過靶向抑制KLF6 的表達來實現(xiàn)。由于本研究僅僅在細胞層面進行了初步探索，將來需要進一步通過體內(nèi)試驗來驗證miR-181a-5p調(diào)控PAH 的機制。