侖伐替尼對甲狀腺癌TPC-1細胞生物學行為的影響

齊 蕾，葉健文，薛文華，張會娟

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

據(jù)報道[1]，我國甲狀腺癌發(fā)病率位于惡性腫瘤第7位。乳頭狀癌是分化型甲狀腺癌中最常見的病理類型[2]。侖伐替尼是美國臨床腫瘤學會及中國臨床腫瘤學會推薦的肝細胞癌一線用藥。近期研究[3]表明侖伐替尼有應用于未分化甲狀腺癌的優(yōu)勢。關于侖伐替尼在分化型甲狀腺乳頭狀癌中作用的研究尚未見報道，本研究探討侖伐替尼對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖、凋亡和轉移等生物學行為的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物與主要試劑人甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC-1購自武漢普賽諾生命科技有限公司。TPC-1細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。裸鼠購自北京華阜康實驗動物有限公司。侖伐替尼、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)購自中國上海藍木化工有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自武漢普賽諾生命科技有限公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，2.5 g/L胰蛋白酶及BCA試劑盒購自南通碧云天公司，RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑購自北京康為世紀科技有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，24孔Transwell侵襲小室購自Corning公司，PVDF購自Millipore公司?；|(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、磷酸化的蛋白激酶B(phospho-AKT kinase，p-AKT)、Cleaved Caspase-9、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62及GAPDH一抗購自武漢Proteintech 公司,p-AKT購自Abcam公司。

1.2 細胞克隆形成能力檢測收集處于對數(shù)生長期的細胞接種至12孔板中，約500個/孔，分為陰性對照組(不處理)與侖伐替尼組(20 μmol/L侖伐替尼處理)。侖伐替尼作用細胞48 h后每3～5 d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時，棄去培養(yǎng)基，甲醇固定20 min，結晶紫染色，PBS清洗3次，光學顯微鏡拍照觀察。實驗重復3次。

1.3 細胞凋亡情況檢測按照1.2分組。使用不含有EDTA的胰蛋白酶消化，輕柔吹打制成單細胞懸液，1 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，再次收集細胞。加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕吹打混勻，避光、室溫孵育10 min后，加入400 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，混勻后上BD流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.4 細胞轉移和侵襲能力檢測收集處于對數(shù)生長期的TPC-1細胞分為陰性對照組(不處理)與侖伐替尼組(40 μmol/L侖伐替尼處理48 h)。制備TPC-1細胞懸液。轉移能力檢測：上室加入100 μL無血清RPMI 1640細胞懸液，約5×105個細胞，預先將含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基加入下室，在不含有基質(zhì)膠的情況下進行試驗。侵襲能力檢測：侵襲小室BD基質(zhì)膠鋪板后，上室加入100 μL含TPC-1細胞的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，約3×103個細胞，下室加入600 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。置37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。甲醇固定20 min，結晶紫溶液染色 20 min，PBS洗2次，輕輕擦去上室細胞。選取5個視野，倒置顯微鏡(×200)下觀察并計數(shù)轉移細胞和侵襲細胞。實驗重復3次。

1.5 TPC-1細胞中Cleaved Caspase-9、MMP-2、p-AKT、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白表達的檢測采用Western blot法。收集TPC-1細胞，分為陰性對照組(不處理)和20、40 μmol/L侖伐替尼組(分別用20、40 μmol/L侖伐替尼處理48 h)，用RIPA裂解液冰上裂解細胞約20 min，高速離心提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，與SDS上樣緩沖液充分混勻后，煮沸5 min。取相同量總蛋白上樣，配制80～120 g/L的SDS-PAGE，經(jīng)電泳、濕轉膜，50 g/L脫脂奶粉室溫搖床封閉1～2 h，所得聚偏二氟乙烯膜(PVDF)在4 ℃冰箱孵育，加入相應一抗(Cleaved Caspase-9、MMP-2、p-AKT、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、GAPDH分別按1∶300、1∶600、1∶1 000、1∶800、1∶800、1∶1 000、1∶5 000稀釋)過夜，1×TBST漂洗3次，10 min/次，在室溫下加入與辣根過氧化酶結合的二抗孵育，用南通碧云天公司超敏增強型電化學發(fā)光液在暗室下顯影曝光，膠片定影，Photoshop分析，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6 侖伐替尼和3-MA對細胞自噬、增殖、凋亡的影響收集處于對數(shù)生長期的TPC-1細胞分為陰性對照組(不處理)、侖伐替尼組(20 μmol/L侖伐替尼處理48 h)、3-MA組(5 mmol/L 3-MA處理48 h)、侖伐替尼+3-MA組。按CCK-8試劑盒使用說明書要求檢測細胞增殖能力，以相對存活率表示。采用1.3的方法檢測細胞凋亡情況，采用1.5的方法檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白的表達。實驗重復3次。

1.7 移植瘤實驗TPC-1細胞重懸在無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中。10只裸鼠于右側腋下(前肢)接種約1×107個細胞，定期觀察腫瘤生長情況。待腫瘤生長至平均體積100 mm3時根據(jù)腫瘤大小和裸鼠體重隨機分兩組(5只/組)給藥。對照組裸鼠胃內(nèi)灌注PBS，侖伐替尼組裸鼠灌注侖伐替尼25 mg/(kg·d)，用藥3周。根據(jù)腫瘤生長速度,每周測小鼠體重和腫瘤大小2～3次。腫瘤體積(mm3)= 1/2 ×(腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2)。記錄3周后瘤體體積和質(zhì)量。

1.8 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0進行分析。2組細胞克隆、凋亡、轉移情況和裸鼠瘤體體積、質(zhì)量的比較采用兩獨立樣本t檢驗；3組細胞Cleaved Caspase-9、MMP-2、p-AKT、P62蛋白表達以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，侖伐替尼和3-MA對TPC-1細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、增殖及凋亡的影響釆用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組TPC-1細胞克隆形成和凋亡情況檢測結果見表1。侖伐替尼可抑制TPC-1細胞克隆形成能力，誘導TPC-1細胞凋亡。

2.2 2組TPC-1細胞轉移及侵襲能力檢測結果見圖1、表2。侖伐替尼可抑制TPC-1細胞的轉移及侵襲。

表1 2組TPC-1細胞克隆及凋亡比較

A：陰性對照組；B：侖伐替尼組

表2 2組TPC-1細胞轉移及侵襲能力比較

2.3 3組TPC-1細胞Cleaved Caspase-9、MMP-2及p-AKT蛋白表達的比較見圖2、表3。侖伐替尼組凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-9表達增加，而基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及p-AKT表達下降。

2.4 3組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、P62蛋白表達的比較見圖3、表4。20和40 μmol/L侖伐替尼組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升，P62蛋白表達下降。

2.5 侖伐替尼和3-MA對細胞自噬、增殖、凋亡的影響見圖4、表5。3-MA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降。與侖伐替尼組比較，侖伐替尼+3-MA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降。與侖伐替尼組比較，侖伐替尼+3-MA組抑制TPC-1細胞增殖、誘導細胞凋亡。

2.6 侖伐替尼對甲狀腺癌TPC-1移植瘤的作用見表6。與對照組比較，侖伐替尼組瘤體體積及質(zhì)量明顯降低，提示侖伐替尼可抑制甲狀腺癌移植瘤生長。

1：陰性對照組；2：20 μmol/L侖伐替尼組；3：40 μmol/L侖伐替尼組圖2 3組細胞中Cleaved Caspase-9、MMP-2和p-AKT蛋白的表達

表3 3組細胞中Cleaved Caspase-9、MMP-2和p-AKT蛋白的表達

1：陰性對照組；2：20 μmol/L侖伐替尼組；3：40 μmol/L侖伐替尼組

表4 3組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、P62蛋白表達的比較

1：陰性對照組；2：侖伐替尼組；3：3-MA組；4：侖伐替尼+3-MA組

表5 侖伐替尼及3-MA對TPC-1細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、增殖及凋亡的影響

表6 侖伐替尼對TPC-1裸鼠移植瘤的影響

3 討論

侖伐替尼是多種激酶抑制劑，具有抗腫瘤血管形成的作用[4]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)由p100催化亞基和p85調(diào)節(jié)亞基組成。正常生理情況下，PI3K以無活性的狀態(tài)存在細胞中，當受到刺激后，PI3K被激活，產(chǎn)生第二信使PIP3，從而募集并激活蛋白激酶B(AKT)[5]。研究[6]表明AKT信號通路的異?；罨c惡性腫瘤的進展有密切關系，特別是在甲狀腺癌等內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤中扮演重要的角色[7-8]。研究[9-10]顯示，侖伐替尼可通過調(diào)控AKT通路抑制膽囊癌及非小細胞肺癌的生長。本研究參考相關文獻[10-11]，并根據(jù)課題組前期預實驗結果，最終選擇20和40 μmol/L侖伐替尼用于后續(xù)實驗，結果顯示侖伐替尼可抑制甲狀腺癌TPC-1細胞的生長及克隆形成能力，并可能通過p-AKT/Cleaved Caspase-9/MMP-2通路誘導TPC-1細胞凋亡及抑制其轉移和侵襲；動物實驗也證實了侖伐替尼對TPC-1移植瘤生長的抑制作用。

本研究結果亦顯示侖伐替尼可活化TPC-1細胞的自噬水平。自噬除為細胞供應能量外，在維護細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進細胞的自我修復能力，清除細胞內(nèi)異常堆積的蛋白產(chǎn)物和失去功能的細胞器中亦扮演重要的角色。自噬除為正常細胞供應能量外，亦可為腫瘤細胞提供生長所需能力，但自噬的過度活化，可加重細胞的損傷，甚至可促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡[12]。本課題組前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可誘導甲狀腺癌TPC-1細胞發(fā)生自噬，降低二甲雙胍的抗腫瘤活性。本研究結果顯示侖伐替尼誘導了甲狀腺癌TPC-1細胞自噬的發(fā)生。此外，應用3-MA特異性自噬阻斷劑可增加侖伐替尼對甲狀腺癌TPC-1細胞的抗腫瘤效果。以上結果提示侖伐替尼在抗腫瘤的同時可能通過誘導自噬，降低TPC-1細胞對侖伐替尼的敏感性，為臨床侖伐替尼藥效不佳的患者提供新的治療思路。

綜上所述，侖伐替尼抑制TPC-1細胞生長及轉移、誘導凋亡及自噬，可能與p-AKT/Cleaved Caspase-9/MMP-2通路相關。