TGF-β2、TGF-β3啟動(dòng)子甲基化在TCDD誘發(fā)小鼠腭裂過程中的作用

陳 露，陳 瑤，高 湛，劉小轉(zhuǎn)，陶宇昌，余增麗

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院保健部 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 4)河南省人民醫(yī)院?jiǎn)渭?xì)胞研究中心 鄭州 450003 5)河南省人民醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科 鄭州 450003 6)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

腭裂是人類最常見的出生缺陷之一，發(fā)病率為10.63/10 000活產(chǎn)兒[1]。環(huán)境和遺傳因素的異常均可導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是工業(yè)燃燒過程中產(chǎn)生的對(duì)人體和環(huán)境有害的持久性有機(jī)污染物。有報(bào)道[2]哺乳動(dòng)物孕期接觸過多TCDD可出現(xiàn)死產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎以及包括腭裂在內(nèi)的出生缺陷。近年來，表觀遺傳學(xué)在腭裂發(fā)生中的作用越來越受到重視。研究[3]發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾參與TCDD誘導(dǎo)的腭裂過程，其中DNA甲基化被認(rèn)為在腭裂形成過程中發(fā)揮了重要作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)在哺乳動(dòng)物腭發(fā)育過程中扮演重要角色[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)TGF-β2或TGF-β3基因敲除小鼠出現(xiàn)了包括腭裂在內(nèi)的多種出生缺陷。因此，我們比較了正常和TCDD誘導(dǎo)的胎鼠腭組織中TGF-β2和TGF-β3啟動(dòng)子甲基化水平和基因表達(dá)水平，探討TGF-β2以及TGF-β3啟動(dòng)子甲基化對(duì)TCDD誘導(dǎo)腭裂發(fā)生的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑63只6～8周齡C57BL/6N系成年小鼠(雄鼠21只，雌鼠42只)購于北京維通利華有限公司(合格證號(hào)No.1100111911039761、1100111911014659)。飼養(yǎng)條件為溫度(20±2) ℃，濕度(50±5)%，光暗12 h交替。TCDD和二甲基亞砜購于美國(guó)Sigma公司，玉米油購于山東三星產(chǎn)業(yè)科技有限公司，中性蛋白酶購于上海羅氏制藥有限公司，Trizol購于美國(guó)Life Technologies公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，TGF-β2和TGF-β3抗體購于美國(guó)Pepro Tech公司，小鼠抗兔β-actin單克隆抗體購于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組63只小鼠在屏障環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，雌雄小鼠于晚8點(diǎn)按2∶1比例合籠，次日早8點(diǎn)查到陰栓則記為妊娠第0天(gestation day 0,GD0)，將42只孕鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(n=21)和TCDD組(n=21)，TCDD組于GD10用64 μg/kg的TCDD(用玉米油配制成10 mg/L)經(jīng)口一次性灌胃，對(duì)照組以等體積玉米油一次性灌胃。

1.3 標(biāo)本制備對(duì)照組和TCDD組孕鼠分別于GD13、GD14、GD15隨機(jī)取3只頸椎脫臼處死，剖腹取胎鼠頭部，用40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后，頭喙部朝下，石蠟包埋切片；同法隨機(jī)另取3只孕鼠的胎鼠，用眼科剪分離胎鼠腭突后，提取總RNA，用于TGF-β2和TGF-β3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)；每組余3只孕鼠于GD14提取胎鼠腭組織總DNA后進(jìn)行甲基化檢測(cè)。

1.4 胎鼠腭組織形態(tài)學(xué)觀察石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后行HE染色，后經(jīng)脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 胎鼠腭組織中TGF-β2、TGF-β3 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)用Trizol提取胎鼠腭組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，制備PCR反應(yīng)體系(共20 μL：cDNA 2.0 μL，SYBR 10.0 μL，引物1.6 μL，無RNase dH2O 6.4 μL)。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，64 ℃退火15 s，然后72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：TGF-β2上游5’-GCTGAGCGCTTTTCTGATCCT-3’，下游5’-CGAGT GTGCTGCAGGTAGACA-3’；TGF-β3上游5’-GGACTTCGGCCACATCAAGAA-3’,下游5’- TAGGGGACGTGGGTCATCAC-3’;內(nèi)參β-actin上游5’-CTGT GCCCATCTACGAGGGCTAT-3’,下游5’-TTTGAT GTCACGCACGATTTCC-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 胎鼠腭組織中TGF-β2、TGF-β3啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)根據(jù)QIAamp DNA Mini試劑盒(Qiagen公司)說明書提取胎鼠腭組織DNA并進(jìn)行CpG位點(diǎn)甲基化檢測(cè)。使用Sequenom公司Epidesigner (http://www.epidesigner.com)設(shè)計(jì)引物，見表1、2。亞硫酸氫鹽處理胎鼠腭組織DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系9 μL，擴(kuò)增條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 45 s，62 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min(10個(gè)循環(huán))；94 ℃ 45 s，57 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min(35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 3 min。產(chǎn)物經(jīng)堿性磷酸酶處理、純化、點(diǎn)樣，最后進(jìn)行質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)通過EpiTYPER軟件(Sequenom公司)進(jìn)行分析并輸出結(jié)果。

表1 TGF-β2啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物

表2 TGF-β3啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2組TGF-β2、TGF-β3啟動(dòng)子甲基化水平和mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組胎鼠腭組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖1。GD13對(duì)照組和TCDD組胎鼠腭部形態(tài)無差異。GD14、GD15，對(duì)照組胎鼠雙側(cè)腭架抬高至舌體上方，并彼此接觸融合；而TCDD組胎鼠雙側(cè)腭架太小以至于無法彼此接觸融合，導(dǎo)致腭裂。

2.2 2組胎鼠腭組織TGF-β2、TGF-β3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較見表3、4。與對(duì)照組相比，GD13～GD15 TCDD組胎鼠TGF-β2和TGF-β3 mRNA表達(dá)水平均降低。

A、C、E：對(duì)照組GD13、GD14、GD15；B、D、F：TCDD組GD13、GD14、GD15

表3 2組胎鼠腭組織TGF-β2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(n=3)

表4 2組胎鼠腭組織TGF-β3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(n=3)

2.3 2組GD14胎鼠腭組織中TGF-β2、TGF-β3啟動(dòng)子甲基化水平比較見表5～9。2組TGF-β2和TGF-β3整體甲基化程度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是與對(duì)照組相比，TCDD組TGF-β2的CpG10、CpG32.33.34位點(diǎn)甲基化水平降低，CpG14、CpG18.19、CpG25和CpG29甲基化水平升高；TGF-β3中CpG2.3、CpG16.17.18、CpG6甲基化水平升高，而CpG18甲基化水平降低。

表5 2組胎鼠TGF-β2、TGF-β3整體甲基化水平比較(n=3) %

表6 2組胎鼠TGF-β2片段1甲基化水平比較(n=3) %

表7 2組胎鼠TGF-β2片段2甲基化水平比較(n=3) %

表8 2組胎鼠TGF-β3片段1甲基化水平比較(n=3) %

表9 2組胎鼠TGF-β3片段2甲基化水平比較(n=3) %

3 討論

本研究中我們利用TCDD構(gòu)造胎鼠腭裂模型，評(píng)估胎鼠腭組織中TGF-β2和TGF-β3的表觀遺傳調(diào)控及其在TCDD誘導(dǎo)腭裂過程中的作用。HE染色結(jié)果顯示TCDD組腭發(fā)育異常，這與先前的研究[7]結(jié)果一致。由于GD14是胎鼠腭發(fā)育過程中雙側(cè)腭架接觸融合的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[8-9]，我們選取GD14胎鼠腭組織DNA進(jìn)行TGF-β2和TGF-β3啟動(dòng)子甲基化分析，結(jié)果顯示，盡管對(duì)照組和TCDD組TGF-β2、TGF-β3啟動(dòng)子整體甲基化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但啟動(dòng)子個(gè)別位點(diǎn)甲基化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有證據(jù)[10-11]表明，啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化可以抑制基因表達(dá)，去甲基化則激活基因表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，TGF-β2兩個(gè)片段共6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，其中4個(gè)位點(diǎn)甲基化水平升高，2個(gè)位點(diǎn)甲基化水平降低；TGF-β3兩個(gè)片段共4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，其中3個(gè)位點(diǎn)甲基化水平升高，1個(gè)位點(diǎn)甲基化水平降低。本研究中TCDD組胎鼠腭組織中TGF-β2和TGF-β3 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組。因此，我們推測(cè)TCDD導(dǎo)致的TGF-β2和(或)TGF-β3基因表達(dá)降低，可能與TGF-β2和(或)TGF-β3啟動(dòng)子部分位點(diǎn)甲基化有關(guān)。

TGF-β2在胎鼠腭組織中的表達(dá)水平降低，這似乎并不足以引發(fā)腭裂，因?yàn)榇饲霸赥GF-β2基因敲除小鼠中腭裂僅表現(xiàn)出低于25%的外顯率[6]。Fox2基因敲除模型顯示腭架發(fā)育不良，作者間接地將其歸因于TGF-β2表達(dá)下降及Smad信號(hào)通路的作用[12]。綜上，我們推測(cè)TGF-β2可能不直接參與腭架的生長(zhǎng)。

有研究[5]發(fā)現(xiàn)TGF-β3基因敲除小鼠表現(xiàn)出以中線上皮縫持續(xù)存在為特征的腭部融合失敗導(dǎo)致的腭裂，體外實(shí)驗(yàn)[13]中也發(fā)現(xiàn)高劑量TCDD可使腭突間充質(zhì)細(xì)胞中TGF-β3表達(dá)降低。本研究結(jié)果顯示，TCDD組胎鼠腭組織中TGF-β3 mRNA表達(dá)降低。由此我們推測(cè)，TGF-β3的表達(dá)降低似乎更有可能干擾了雙側(cè)腭部融合而不是阻礙腭架的生長(zhǎng)。

綜上，TCDD可能通過誘導(dǎo)啟動(dòng)子部分位點(diǎn)發(fā)生甲基化影響TGF-β2和(或)TGF-β3在腭架中的表達(dá)，進(jìn)而影響腭架的生長(zhǎng)(間接或直接通過TGF-β2)以及雙側(cè)腭部融合(直接通過TGF-β3)，從而導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。本研究只探討了TGF-β2和TGF-β3基因水平的改變，未來我們將繼續(xù)深入探討蛋白水平的機(jī)制。