利用人氣道基底細(xì)胞體外構(gòu)建類氣管球

張文平，劉 姿，賈建超，魏 立，張曉菊

1)河南省人民醫(yī)院(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院；河南大學(xué)人民醫(yī)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院；河南大學(xué)人民醫(yī)院)胸外科 鄭州 450003

人氣道基底細(xì)胞存在于氣管和直徑大于1 mm的支氣管上皮內(nèi)，是肺內(nèi)源性干細(xì)胞的一種。研究[1]表明氣道基底細(xì)胞中存在多能干細(xì)胞，其可隨機(jī)分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。這一特點(diǎn)決定了人氣道基底細(xì)胞在肺損傷修復(fù)中發(fā)揮一定的作用。利用人氣道基底細(xì)胞生成的類氣管球成熟后由復(fù)層纖毛細(xì)胞、分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞和基底細(xì)胞組成[2]。由氣道基底細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得的類氣管球可用于研究調(diào)節(jié)基底細(xì)胞增殖和分化的小分子和藥物，也可用于研究治療纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞比例失調(diào)疾病(哮喘、慢性阻塞性肺疾病和囊性纖維化等)的新方法。本研究應(yīng)用人氣道基底細(xì)胞構(gòu)建類氣管球，并觀察不同來(lái)源的基底細(xì)胞所形成類氣管球的差別。

1 材料與方法

1.1 材料肺組織來(lái)源于河南省人民醫(yī)院肺移植中心肺移植手術(shù)棄用的供肺。主要試劑：含谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司),EpiX Base培養(yǎng)基(Propagenix 公司)，Ham′s F-12 Nutrient Mix完全培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司)，膠原酶P、蛋白酶ⅩⅣ、DNA酶Ⅰ、膠原蛋白溶液、KRT5單抗、PKH26熒光細(xì)胞膜染色試劑盒(Sigma-Aldrich公司)，基質(zhì)膠(Corning公司)，p63-α(D2K8X) XP?兔單抗(Cell Signaling Technology公司)，MUC5A 單抗、FOXJ1單抗、山羊抗雞 488抗體、山羊抗鼠555(Thermo Scientific公司),山羊抗兔647抗體(Novus Biologicals公司)。自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀2000(Nexcelom Biosicence公司)，倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡。

1.2 原代人肺成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)于超凈工作臺(tái)使用無(wú)菌手術(shù)剪將肺組織(來(lái)自一名77歲男性，無(wú)肺部基礎(chǔ)疾病)剪成細(xì)小碎片(約1 mm3)，加入0.5 g/L胰蛋白酶-EDTA酚紅，37 ℃水浴10 min后用無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液1 600 r/min離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液5 min后離心，以完全培養(yǎng)基重懸，1 600 r/min離心5 min，棄上清，再重懸細(xì)胞。將所得細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，以Ham′s F-12 Nutrient Mix完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得細(xì)胞為肺成纖維細(xì)胞。細(xì)胞融合度80%左右時(shí)可進(jìn)行傳代。細(xì)胞保存于含體積分?jǐn)?shù)10%二甲基亞砜的胎牛血清中，液氮罐內(nèi)長(zhǎng)期保存。

1.3 人氣道基底細(xì)胞的分離培養(yǎng)使用酶消化法從人氣管或支氣管標(biāo)本分離氣道基底細(xì)胞。第1天以蛋白酶和DNA酶Ⅰ消化氣管和支氣管組織，第2天以手術(shù)刀片輕輕搔刮氣管或支氣管內(nèi)膜，收集細(xì)胞接種于膠原蛋白溶液包被的T75或T175長(zhǎng)頸培養(yǎng)瓶，用EpiX Base培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h。所得細(xì)胞經(jīng)KRT5和P63免疫熒光染色鑒定為氣道基底細(xì)胞。細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)可進(jìn)行傳代。建議人氣道基底細(xì)胞保存于第一代。

1.4 類氣管球的體外培養(yǎng)與鑒定所有操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。取24孔板，每孔用100 μL體積比1∶1混合的基質(zhì)膠與EpiX Base培養(yǎng)基包被，冰上操作。然后將24孔板置于37 ℃溫箱中30 min使凝膠固化。

使用PKH26預(yù)染人肺成纖維細(xì)胞胞膜(紅色)，以在熒光顯微鏡下區(qū)分氣道基底細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。冰上分別將氣道基底細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞重懸于冷的EpiX Base培養(yǎng)基中，充分混勻，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。將100 μL細(xì)胞懸液(含基底細(xì)胞及肺成纖維細(xì)胞各5×104個(gè))與等體積基質(zhì)膠混勻，所得細(xì)胞懸液接種于24孔板，每孔200 μL。將培養(yǎng)板置于37 ℃溫箱30 min，待凝膠固化后每孔加入700 μL EpiX Base培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2溫箱、37 ℃培養(yǎng)。隔日更換EpiX Base培養(yǎng)基。定期觀察細(xì)胞形態(tài)及有無(wú)類氣管球形成。以單獨(dú)培養(yǎng)的基底細(xì)胞或肺成纖維細(xì)胞為對(duì)照。

棄去培養(yǎng)基，每孔加入福爾馬林1 mL靜置2 h。將固定后的類氣管球轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，400×g離心6 min。加1 mL體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton-X100室溫下透化1 h，400×g離心6 min，棄上清。加30 g/L牛血清白蛋白(溶于PBS)室溫下封閉1～2 h，400×g離心6 min，棄上清。以200 μL PBS重懸，轉(zhuǎn)移至玻璃底的24孔板內(nèi)，每孔10 μL。加一抗KRT5(1∶1 000稀釋)、P63-α(1∶800稀釋)、MUC5A(1∶150稀釋)、FOXJ1(1∶200稀釋)，4 ℃過(guò)夜。加二抗山羊抗雞488、山羊抗鼠555、山羊抗兔647抗體(均按1∶2 000稀釋)，室溫1 h，400×g離心6 min。然后以DAPI復(fù)染細(xì)胞核。

1.5 老年株、青年株基底細(xì)胞類氣管球形成效率的比較分離青年和老年健康供者的氣道基底細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞，方法同上。分別將青年株、老年株氣道基底細(xì)胞和青年株、老年株肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察形成的類氣管球的大小和數(shù)量。聯(lián)合培養(yǎng)前氣道基底細(xì)胞老年株細(xì)胞活性為71.6%，青年株為84.0%，人肺成纖維細(xì)胞老年株活性為93.0%，青年株為90.0%。

2 結(jié)果

2.1 類氣管球的鏡下表現(xiàn)培養(yǎng)第11天，氣道基底細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或與肺成纖維細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)均可見(jiàn)類氣管球形成，肺成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)無(wú)類氣管球形成(圖1)。氣道基底細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)形成的類氣管在鏡下呈球形，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)球體直徑逐漸增大，14～21 d時(shí)達(dá)峰值。

A、B、C：分別為氣道基底細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)、氣道基底細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、肺成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；1、2：分別為亮視野和暗視野，暗視野下B2未見(jiàn)紅色熒光，說(shuō)明無(wú)肺成纖維細(xì)胞

2.2 類氣管球的細(xì)胞組成氣道基底細(xì)胞所形成的類氣管球結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2A，類氣管球表面為基底細(xì)胞，纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞分布在管腔內(nèi)。免疫熒光染色可見(jiàn)基底細(xì)胞(KRT5+P63+)分布于類氣管球體表面，纖毛細(xì)胞(FOXJ1+)和分泌細(xì)胞(MUC+)分布在管腔內(nèi)部(圖2B、C)；纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞均由基底細(xì)胞分化而來(lái)。

A：類氣管球示意圖；B：類氣管球外部分布著表達(dá)KRT5(綠色熒光)和P63(紅色熒光)的基底細(xì)胞(免疫熒光染色，×400)；

2.3 老年株、青年株基底細(xì)胞類氣管球形成效率的比較來(lái)源于青年和老年健康供者的氣道基底細(xì)胞分別與來(lái)源于青年和老年健康供者的肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，可以觀察到形成類氣管球的大小和數(shù)量存在區(qū)別(圖3)；全視野下(圖4)可見(jiàn)，培養(yǎng)第20天，與基底細(xì)胞青年株相比，基底細(xì)胞老年株與成纖維細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)所形成的類氣管球直徑更大，數(shù)量更多。

3-1、3-2：氣道基底細(xì)胞老年株分別與肺成纖維細(xì)胞青年、老年株共培養(yǎng)，箭頭所示球體或類球體為類氣管；3-3、3-4：氣道基底細(xì)胞青年株分別與肺成纖維細(xì)胞青年、老年株共培養(yǎng)，箭頭所示球體或類球體為類氣管

A、B：氣道基底細(xì)胞老年株(Basal Cell Old)分別與肺成纖維細(xì)胞青年株(hLF Young)及肺成纖維細(xì)胞老年株(hLF Old)共培養(yǎng)20 d；C、D：氣道基底細(xì)胞青年株(Basal Cell Young)分別與hLF Young及hLF Old共培養(yǎng)20 d

3 討論

目前體外類肺器官可提供研究細(xì)胞間相互作用的平臺(tái)，也是體外合成可植入氣道組織治療慢性肺部疾病的第一步。人氣道基底細(xì)胞中存在多能干細(xì)胞，可隨機(jī)分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定，在肺損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用。原代人氣道基底細(xì)胞的分離常采用以下3種臨床標(biāo)本：①因挫傷嚴(yán)重或感染廢棄不用的肺移植供肺或單肺移植時(shí)非手術(shù)側(cè)的供肺、供肺減容的部分。②切除的病肺。③支氣管鏡檢查時(shí)刷檢或活檢標(biāo)本。前兩種標(biāo)本可用于實(shí)驗(yàn)室研究，并建立細(xì)胞庫(kù)。用第3種方法獲取的標(biāo)本體外與不能進(jìn)行有絲分裂的肺成纖維細(xì)胞在Rho激酶抑制劑存在的情況下共培養(yǎng)，可快速擴(kuò)增氣道基底細(xì)胞，用于人工氣管的生物工程臨床研究[3]。

本研究利用廢棄供肺的氣管或支氣管分離人氣道基底細(xì)胞，利用肺組織分離成纖維細(xì)胞。人氣道基底細(xì)胞非常敏感，在分離和培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格按照操作方案要求，尤其應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①嚴(yán)格遵守各步驟對(duì)溫度、時(shí)間、轉(zhuǎn)速等的要求。②在使用無(wú)菌手術(shù)刀搔刮氣管或支氣管內(nèi)膜時(shí)避免過(guò)深突破基底膜，以避免其他類型細(xì)胞的污染。③由于肺是開放器官，在基底細(xì)胞分離培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)注意到污染的概率較大。④由于基底細(xì)胞具有分化能力，建議保存第一代細(xì)胞用于研究。

本研究結(jié)果表明類氣管球可由基底細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)生成，也可由基底細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)生成；免疫熒光染色證實(shí)類氣管球表面分布著基底細(xì)胞，腔內(nèi)可見(jiàn)纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞。既往文獻(xiàn)[2,4]報(bào)道，人肺成纖維細(xì)胞和氣道基底細(xì)胞共培養(yǎng)，或在培養(yǎng)基中添加Rho激酶抑制劑可將類器官形成的效率由10%提高到20%。在類器官培養(yǎng)體系中，肺成纖維細(xì)胞缺失時(shí)，肺上皮細(xì)胞的自凝聚現(xiàn)象減弱，且無(wú)法形成管狀結(jié)構(gòu)。抑菌素、Rho激酶抑制劑Y27632、肌動(dòng)蛋白聚合細(xì)胞松弛素D均具有影響肌動(dòng)球蛋白介導(dǎo)收縮的作用，從而促進(jìn)體外類器官形成管狀結(jié)構(gòu)并使其體積增大[5-6]。

有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)氣道基底細(xì)胞老年株與人肺成纖維細(xì)胞老年株或青年株共培養(yǎng)均較基底細(xì)胞青年株形成類氣管的數(shù)量多且體積大，但仍需要更多細(xì)胞株，并優(yōu)化計(jì)數(shù)、直徑測(cè)量方法，進(jìn)一步比較證實(shí)，具體機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。結(jié)合Mou等[7]的研究，轉(zhuǎn)化生成因子β(TGFβ)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/SMAD信號(hào)通路在氣道基底細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中起重要作用；SMAD磷酸化可促進(jìn)基底細(xì)胞的分化，敲除TGFβ/BMP基因和抑制藥物均可阻礙基底細(xì)胞分化為纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞。氣道基底細(xì)胞的老年株和青年株可能在TGFβ/BMP/SMAD信號(hào)通路的基因表達(dá)和調(diào)節(jié)方面存在一定差異，可進(jìn)行相關(guān)的研究進(jìn)一步探討。

體外類肺器官是一個(gè)較新的研究領(lǐng)域。本研究成功在體外構(gòu)建了類氣管球模型，其可在體外模擬氣道生理，為氣道的發(fā)生發(fā)育、生理和疾病相關(guān)研究提供模型支持。