B(A)04亞型家系的血清學(xué)及分子遺傳學(xué)分析

宋 婕，張一煒，孔永奎，王書亞，呂先萍

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科 鄭州 450052 2)南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510515

ABO抗原是重要的血型系統(tǒng)抗原。ABO血型不合會引起溶血性輸血反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)及新生兒溶血病，因此，精準(zhǔn)的ABO血型鑒定對于臨床救治非常重要[1]。臨床ABO血型鑒定困難通常與患者的病理性疾病狀態(tài)、藥物或者遺傳因素等密切相關(guān)，前兩者伴隨疾病的發(fā)生發(fā)展或者用藥的變化而有所改變，后者則常見于ABO血型亞型[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ABO血型亞型有300多個，其中B(A)亞型有6個[3]。通常認(rèn)為B(A)亞型等位基因是在正常B.01等位基因的基礎(chǔ)上發(fā)生單堿基突變形成的，其表達產(chǎn)物除了具有較高的B糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase B，GTB)活性外，還具有少量的A糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase A，GTA)活性[4]；在血清學(xué)上一般表現(xiàn)為較強的B抗原和很弱的A抗原，但具體個體間存在一定的差異性。本研究通過一例B(A)04亞型的鑒定、家系分析及交叉配血，探討其血清學(xué)及分子遺傳學(xué)特征，分析其合理的臨床輸血策略。

1 對象與方法

1.1 研究對象先證者，男，7歲，因鼻中隔腫大擬行手術(shù)治療在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科進行手術(shù)備血，ABO血型血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)正反定型不一致，需要進一步鑒定；無輸血史，無家族遺傳性疾病史，無血液系統(tǒng)疾病史，無近期感染。采集其祖父母、父母及弟弟血標(biāo)本進行ABO血型血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測，家系成員均知情同意。

1.2 ABO血型血清學(xué)檢測主要試劑和儀器包括單克隆抗A、抗B血型定型試劑(長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，ABO血型反定型試劑盒、抗人球蛋白檢測卡及低離子鹽溶液(長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，抗A1、抗H血型定型試劑 (荷蘭Sanquin公司)，抗AB 血型定型試劑(上海血液生物醫(yī)藥公司)，人源抗A血型定型血清(正常獻血員血清，測定效價為128)，凝聚胺試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，血型血清學(xué)離心機(日本久保田株式會社，型號KA2200)，卡式離心機(長春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司，型號TD-A)。血型血清學(xué)檢測、抗體篩查及交叉配血參照第18版《AABB技術(shù)手冊》[5]進行。

1.3 ABO基因的擴增和測序采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的血液基因組DNA抽提試劑盒提取被檢者全血DNA。參照文獻[6]的方法擴增 ABO基因第6、7外顯子，PCR擴增及測序引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取5 μL PCR產(chǎn)物加入10 g/L瓊脂糖凝膠中，150 V 100 mA電泳10～20 min，確定PCR擴增是否成功。采用SanPrep柱式DNA凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，B518131)純化回收PCR產(chǎn)物，使用美國ABI公司的3730XL測序儀進行測序。

1.4 單倍型測序分析通過TOPO TA克隆試劑盒(美國 Invitrogen公司)對PCR產(chǎn)物進行克隆。將PCR產(chǎn)物用DNA連接酶連接到TA克隆質(zhì)粒pMD18-T中，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，接種至LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取陽性克隆，再接種至LB液體培養(yǎng)基增菌，提取質(zhì)粒DNA進行單倍型測序分析，并與參比序列進行堿基比對。

1.5 吸收放散試驗將BA.04等位基因攜帶者的紅細(xì)胞分別與人源抗A血型定型血清進行吸收放散試驗，鑒定紅細(xì)胞上弱A抗原。

1.6 交叉配血試驗通過鹽水法及凝聚胺法將BA.04等位基因攜帶者的血標(biāo)本分別與A、B、O及AB型獻血者懸浮紅細(xì)胞制品進行交叉配血試驗。

2 結(jié)果

2.1 ABO血型血清學(xué)檢測結(jié)果見表1。先證者及其祖父正反定型不符，表現(xiàn)為AwB或者B(A)亞型，其祖母、父親及弟弟均為B型，母親為O型。

表1 家系成員ABO血型血清學(xué)檢測結(jié)果

2.2 先證者ABO基因及單倍型測序結(jié)果先證者第6外顯子區(qū)存在c.261delG和c.297A>G雜合突變，第7外顯子區(qū)存在c.526C>G、c.640A>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C及c.930G>A 雜合突變；單倍型測序分析結(jié)果顯示先證者一條單倍型基因為O.01.01，另一條為BA.04，其基因型為ABO*BA.04/O.01.01。詳見圖1。

圖1 先證者ABO基因測序結(jié)果(BA.04第7外顯子雜合突變)

參照dbRBC等位基因數(shù)據(jù)進行參比序列堿基比對。結(jié)果顯示：與A1.01比對，BA.04存在c.297A>G、c.526C>G、c.640A>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C及c.930G>A 雜合突變，除c.640A>G外的其余突變可以使A1.01基因變?yōu)锽.01基因；與B.01比對，BA.04存在c.640A>G雜合突變。比對結(jié)果提示BA.04基因是在B.01基因基礎(chǔ)上發(fā)生了點突變，造成其編碼蛋白第214位的甲硫氨酸(Met)被纈氨酸(Val)替代。比對結(jié)果見表2。

表2 BA.04基因與參比序列的堿基比對

2.3 家系分析ABO基因第6、7外顯子測序分析結(jié)果顯示，先證者父親和祖父第7外顯子區(qū)存在c.640A>G雜合突變，符合BA.04等位基因特征；結(jié)合單倍型分析，其祖父基因型為BA.04/O.01.01，其父親為BA.04/B.01，其祖母及弟弟為B.01/O.01.01，其母親為O.01.01/O.01.01。家系分析顯示BA.04等位基因從祖父遺傳至父親再到先證者，而非自然突變，呈現(xiàn)穩(wěn)定遺傳(圖2)。

2.4 吸收放散試驗結(jié)果先證者、父親和祖父BA.04等位基因攜帶者紅細(xì)胞吸收后的人源血清抗A效價由原來的128分別降為16、32和16，吸收后紅細(xì)胞末次洗滌液與Ac、Oc均不凝集，放散液與Ac凝集，與Oc不凝集，說明3位被檢者紅細(xì)胞上存在A抗原。

Ⅰ～Ⅲ：家系代數(shù)；□：正常男性；■：BA.04等位基因攜帶男性；○：正常女性；黑色箭頭：先證者

2.5 交叉配血試驗結(jié)果先證者、父親和祖父BA.04等位基因攜帶者血標(biāo)本抗體篩查均為陰性；與B型或O型懸浮紅細(xì)胞的交叉配血試驗結(jié)果顯示主側(cè)均相合、次側(cè)均不相合；與A型懸浮紅細(xì)胞的交叉配血試驗結(jié)果顯示主次側(cè)均不相合；與AB型懸浮紅細(xì)胞的交叉配血試驗結(jié)果顯示主側(cè)均不相合、次側(cè)均相合。交叉配血結(jié)果見表3。

表3 BA.04等位基因攜帶者交叉配血試驗結(jié)果

3 討論

ABO亞型的血清學(xué)檢測通常表現(xiàn)為紅細(xì)胞與抗A或抗B血型定型試劑的凝集減弱，且血清中往往含有弱抗原對應(yīng)的抗體，而這種現(xiàn)象是由于A基因或B基因發(fā)生突變所導(dǎo)致[7]，這種突變常在家系調(diào)查中呈現(xiàn)穩(wěn)定遺傳特征。因此，在血清學(xué)鑒定困難時，可以結(jié)合基因測序和家系分析進行ABO血型的準(zhǔn)確鑒定[8]。

B(A)亞型相對罕見，其典型的血清學(xué)特征為“弱A強B”，血清中含有抗A抗體。在實際臨床工作中，B(A)亞型可能由于單克隆抗A血型定型試劑的敏感性不同，人源抗A血型定型血清的效價差別以及個體間的基因型差異等，血清學(xué)反應(yīng)呈現(xiàn)出較大差別。大部分B(A)亞型可以被含有鼠源單克隆MHO4的高效價定型試劑篩選出來[5]，建議在進行ABO血型的初檢和復(fù)查時，采用含有MHO4克隆的定型試劑進行檢測來減少B(A)亞型的漏檢[9]。馬會敏等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)單克隆抗A血型定型試劑效價為256時，其檢測的6例B(A)亞型標(biāo)本紅細(xì)胞僅1例出現(xiàn)凝集反應(yīng)，說明B(A)亞型個體間A抗原的表達強弱有一定的差別。人源抗A血型定型血清的效價一般比較低，本研究中所用的人源抗A血型定型血清效價為128，僅先證者祖父紅細(xì)胞與其呈現(xiàn)出弱陽性反應(yīng)，這也進一步印證了上述結(jié)論。洪小珍等[11]在家系調(diào)查時發(fā)現(xiàn)1例B(A)02亞型基因型為BA.02/A1.02，由于A1.02基因?qū)TA的協(xié)同增強作用掩蓋了BA.02基因?qū)е碌纳倭縂TA活性，血清學(xué)表現(xiàn)為正常的AB型。與之相反，本研究中先證者父親血清學(xué)表型為B型，基因型為BA.04/B.01，這可能是B.01基因增加了GTB的活性，更進一步地競爭抑制少量GTA對共同受體物質(zhì)的作用，使先證者父親紅細(xì)胞上A抗原的表達量不足以被現(xiàn)有的某些單克隆抗A血型定型試劑檢測出，而吸收放散試驗顯示，先證者父親紅細(xì)胞能吸收并放散出人源血型定型血清中的抗A抗體，證實其紅細(xì)胞上含有A抗原。因此，在BA基因和A基因或者B基因共同遺傳時，后兩者可能通過相反的作用，協(xié)同增強或競爭抑制，造成B(A)表型被掩蓋而錯判為正常的AB型或者B型。

目前，國內(nèi)外報道的B(A)亞型共有6種，其在我國的發(fā)生率高于歐洲高加索人種，且以B(A)02和B(A)04亞型為主[12]?，F(xiàn)有報道[13-14]顯示這兩種亞型在我國北方和南方江浙一帶分布概率類似，但由于其罕見性，大多為個案報道或家系分析，缺乏大規(guī)模群體調(diào)查，其實際頻率及各亞型在人群中的分布情況還不是特別明確。本例先證者血清學(xué)表型符合AwB或B(A)亞型；基因測序結(jié)果顯示其ABO基因第7外顯子在B.01基因的基礎(chǔ)上發(fā)生了c.640A>G雜合突變，基因型為BA.04/O.01.01，血型為B(A)04亞型；家系調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，BA.04等位基因從祖父遺傳至父親再到先證者，而非自然突變，呈現(xiàn)穩(wěn)定的順式遺傳。第7外顯子c.640A>G單堿基突變可使其編碼蛋白第214位的Met被Val替代。Patenaude等[15]研究發(fā)現(xiàn)GTA和GTB中有一個特征性的211DVD213模序，通過與Mn2+離子結(jié)合，在酶的供體結(jié)合及催化中起重要作用。而Met214Val突變位于211DVD213模序附近，Persson等[16]通過蛋白晶體構(gòu)建分析推測在Met214Val突變中Val可能通過較小的側(cè)鏈導(dǎo)致GTB活性部位附近產(chǎn)生一個疏水性口袋，234位亮氨酸側(cè)鏈移動進入這個口袋后，使關(guān)鍵性氨基酸Met266位(決定GTA/GTB特異性)周圍活性識別口袋變寬，從而可以容納較大的UDP-GalNAc (尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺，A 抗原糖供體)的N-乙?；?，產(chǎn)生較弱的A抗原活性。因此，我們推測BA.04等位基因的分子遺傳基礎(chǔ)來源于ABO基因第7外顯子c.640A>G突變。

在臨床輸血時，B(A)亞型多推薦同型輸血或者相容性輸血[17]，但由于B(A)亞型比較罕見，同型輸血一般難以實現(xiàn)。對于非急診用血的患者可以考慮自體輸血，而對于急診或不適合自體輸血的患者可以選擇B型或O型洗滌紅細(xì)胞和AB型血漿、冷沉淀、血小板進行配合性輸血。本研究中先證者術(shù)前血紅蛋白正常，術(shù)中出血量較少，沒有輸注血液制品。B(A)亞型如果作為獻血者供給正常血型患者，容易出現(xiàn)交叉配血不合，可以作為稀有血型獻血者登記建庫，同時提供稀有血型溫馨提示信息，避免以后延誤診療用血，為患者節(jié)省寶貴的臨床救治時間。