腸道病毒感染致神經(jīng)損傷小鼠腦組織NOD樣受體蛋白3的表達(dá)

張夢(mèng)娣，梁若楠，紀(jì)望全，張 雪，陳 晨，閆玉潔，張楚雯，朱培育，李 棟，陳帥印，楊海燕，段廣才，晉樂飛

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001

手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)是由腸道病毒(enterovirus，EV)感染引起的急性傳染病，5歲以下嬰幼兒普遍易感，具有自限性。HFMD一般臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，手、足、口等部位散發(fā)性皮疹和皰疹，部分病例可發(fā)展為嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如腦炎、腦干腦炎、急性弛緩性麻痹等[1-3]。EV屬于單股正鏈RNA的小核糖核酸病毒，可以通過內(nèi)吞作用感染宿主細(xì)胞并釋放RNA[4]，進(jìn)而激活機(jī)體固有免疫。多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與EV感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，過度的免疫應(yīng)答與HFMD的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[5-7]。HeLa細(xì)胞感染EV71后，促炎因子IL-1β和IL-18的表達(dá)和分泌增加[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，Caspase-1抑制劑可減少EV71在小鼠大腦中的復(fù)制。阻斷IL-1β可以預(yù)防EV感染引起的慢性炎癥[10]。臨床研究[11]證實(shí)，腦炎患兒血清IL-1β水平顯著升高。NOD樣受體是固有免疫的重要組成部分，它可以識(shí)別病毒RNA。NOD樣受體家族成員與炎性小體介導(dǎo)的固有免疫密切相關(guān)，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)是目前研究較為清楚的炎性小體[12]。NLRP3通過凋亡相關(guān)微粒蛋白募集pro-Caspase-1形成炎性小體，pro-Caspase-1聚集后通過自我剪切產(chǎn)生活化的Caspase-1，后者對(duì)pro-IL-1β和pro-IL-18進(jìn)行剪切，最終形成活化的IL-1β和IL-18，這些促炎因子分泌到細(xì)胞外，誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)[13]。研究[14]表明NLRP3炎性小體功能失調(diào)與神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病等。然而，NLRP3炎性小體在EV感染誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用尚不清楚。本研究利用HFMD的常見病原體EV71和相對(duì)少見病原體柯薩奇病毒A組2型(coxsackievirus A2，CVA2)感染小鼠，檢測(cè)小鼠腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，探討NLRP3在EV感染致神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用，有助于揭示HFMD神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，Trizol (美國(guó)Invitrogen公司)；mRNA反轉(zhuǎn)試劑盒和qPCR SYBR Master Mix(上海翌圣生物科技有限公司)，PMSF及RIPA組織裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司)，BCA試劑盒(博邁德生物技術(shù)有限公司)；β-actin、Caspase-1、NLRP3 、IL-1β 一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，山羊抗兔IgG二抗(武漢三鷹生物公司)；VP1一抗、FITC/Cy3雙標(biāo)熒光二抗(武漢塞維爾公司)。Olympus IX73 倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)、WB電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、ECL化學(xué)發(fā)光成系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)、熒光定量PCR儀(北京酷搏科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞和病毒使用人橫紋肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)細(xì)胞富集病毒，細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。EV71毒株(ZZ1350，序列號(hào)KY886010.1)分離自鄭州市兒童醫(yī)院1例重癥HFMD患兒的糞便標(biāo)本，CVA2毒株(HN202009，序列號(hào)MT992622)分離自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1例重癥HFMD患者的糞便標(biāo)本。使用單層RD細(xì)胞檢測(cè)并計(jì)算病毒滴度[15-16]，感染滴度以空斑形成單位(plaque forming unit,pfu)表示。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)5日齡BALB/c小鼠30只購(gòu)自河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0009，常規(guī)飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物房。光照循環(huán)條件為 12 h明/12 h暗，溫度20～24 ℃，濕度40%～60%。30只小鼠分為EV71組、CVA2組和對(duì)照組，每組10只。基于課題組前期的研究[17]，EV71組和CVA2組小鼠分別以4×106和7×103個(gè)pfu的感染滴度經(jīng)腹腔、肌內(nèi)注射EV71和CVA2，對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的RD 細(xì)胞培養(yǎng)上清。感染后觀察小鼠并記錄臨床癥狀和生存情況。

1.4 腦組織病理學(xué)和免疫熒光共定位檢測(cè)感染后第7天，采取異氟烷吸入法對(duì)3組小鼠實(shí)施安樂死，每組取4只小鼠的腦組織，40 g/L多聚甲醛固定并進(jìn)行石蠟包埋、5 μm厚切片，通過HE和尼氏染色觀察腦組織病理學(xué)改變。免疫熒光雙標(biāo)染色標(biāo)記NLRP3和EV71/CVA2 VP1蛋白的表達(dá)，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。

1.5 腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、 IL-18 mRNA的qRT-PCR檢測(cè)感染后第7天，每組取3只小鼠的腦組織，采用Trizol法提取總RNA，合成cDNA。使用qRT-PCR 法檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β、 IL-18的mRNA表達(dá)水平，引物序列和產(chǎn)物大小見表1。反應(yīng)體系：Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、10 mol/L上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 2 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性90 ℃ 30 s;變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法[18]進(jìn)行相對(duì)定量。

1.6 腦組織NLRP3、Caspase-1和IL-1β 蛋白的Western blot檢測(cè)感染后第7天，每組取3只小鼠腦組織，使用含有蛋白酶抑制劑PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA組織裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，100 g/L SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上，使用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h后加一抗(NLRP3、Caspase-1、 IL-1β均按照1∶1 000稀釋)孵育，4 ℃過夜，洗膜3次，加二抗(按照1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜3次，使用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。應(yīng)用Image J軟件分析。以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列和產(chǎn)物大小

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行分析。3組小鼠腦組織中 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、 IL-18 mRNA和NLRP3、Caspase-1和IL-1β 蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EV71和CVA2感染小鼠動(dòng)物模型接種EV71和CVA2的小鼠均在第2天開始精神萎靡、活動(dòng)減少，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，以上癥狀加重，逐漸出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、嗜睡、抽搐、后肢癱瘓等癥狀，且體重明顯下降；EV71組小鼠在感染后3～8 d內(nèi)全部死亡，CVA2組小鼠在感染后4～9 d內(nèi)全部死亡。本研究成功構(gòu)建了EV71和CVA2感染動(dòng)物模型，模擬出與人類疾病相似的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

2.2 3組小鼠腦組織神經(jīng)元病變與對(duì)照組比較，CVA2組和EV71組小鼠腦組織出現(xiàn)血管袖套現(xiàn)象和大范圍的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)，噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象明顯(圖1)。對(duì)照組小鼠腦組織尼氏小體呈正常微粒狀或虎斑狀，且神經(jīng)元排列整齊、邊界清晰、顏色深藍(lán)；而CVA2組和EV71組小鼠的腦組織尼氏小體排列紊亂、顏色淺，有明顯的溶解、變性和碎片化改變(圖2)。

2.3 NLRP3與EV71、CVA2病毒在小鼠腦組織的共定位與對(duì)照組比較，EV71組和CVA2組小鼠腦組織NLRP3的表達(dá)均明顯增加，并且可以檢測(cè)到病毒VP1抗原的陽性信號(hào)。EV71組可見EV71(綠色)與NLRP3(紅色)的共定位細(xì)胞;CVA2組可見CVA2(紅色)與NLRP3(綠色)的共定位細(xì)胞(圖3)。

2.4 3組小鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、 IL-18 mRNA的表達(dá)結(jié)果見表2。與對(duì)照組比較，CVA2組和EV71組小鼠腦組織中Casepase-1、NLRP3、IL-1β以及IL-18 mRNA的表達(dá)升高。

2.5 3組小鼠腦組織 NLRP3、Caspase-1和IL-1β 蛋白的表達(dá)結(jié)果見表3。與對(duì)照組比較，EV71組和CVA2組小鼠腦組織中NLRP3、Caspase-1和IL-1β 蛋白的表達(dá)升高。

A、B、C:分別為對(duì)照組、CVA2組、EV71組；1～3：不同視野

A、B、C:分別為對(duì)照組、CVA2組、EV71組；箭頭示尼氏小體溶解、碎片化

左圖：紅色表示NLRP3,綠色表示EV71抗原； 右圖：綠色表示NLRP3,紅色表示CVA2抗原；白色箭頭示病毒與NLRP3的共定位

表2 3組小鼠腦組織 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、 IL-18 mRNA的表達(dá)

表3 3組小鼠腦組織NLRP3、Caspase-1和IL-1β 蛋白的表達(dá)

3 討論

EV感染引起的HFMD是我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，部分可發(fā)展為重癥，出現(xiàn)腦炎、腦膜炎等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[4]。研究[19-20]表明，EV71感染可直接對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，另外過度的炎癥反應(yīng)也參與EV71感染引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[5]。本研究結(jié)果顯示，EV71和CVA2感染小鼠腦組織出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象以及尼氏小體病變，表明EV71和CVA2感染均引起不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。免疫熒光共定位結(jié)果顯示EV71及CVA2均可感染神經(jīng)系統(tǒng)，NLRP3可能參與EV71和CVA2感染所致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

越來越多的研究[21]認(rèn)為多種免疫細(xì)胞、炎癥因子參與HFMD的發(fā)展，例如伴有嚴(yán)重并發(fā)癥的HFMD患者血漿中IL-1β水平顯著升高。NLRP3炎性小體的激活是調(diào)節(jié)IL-1β分泌的關(guān)鍵[13]。已有研究[22]表明，NLRP3參與了柯薩奇B3病毒(coxsackievirus B3，CVB3)誘導(dǎo)的心肌損傷；EV71感染早期，NLRP3炎性小體通過啟動(dòng)有效的炎癥反應(yīng)來控制EV71的增殖，EV71的蛋白酶2A和3C也可與NLRP3相互作用[23]。有研究[22]發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3可減輕CVB3感染后癥狀。也有報(bào)道[24]稱NLRP3炎性小體對(duì)CVB3感染小鼠有保護(hù)作用。IL-1β是機(jī)體內(nèi)IL-1表達(dá)的活性形式，可以激活免疫細(xì)胞，引起細(xì)胞毒性作用，也可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集參加炎癥反應(yīng)；IL-18屬于IL-1超家族，兩者都可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)[25]。本研究結(jié)果顯示CVA2組和EV71組小鼠腦組織中Caspase-1、NLRP3、IL-1β以及IL-18 mRNA和NLRP3、Caspase-1和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均升高，提示EV71和CVA2感染誘導(dǎo)腦組織NLRP3激活，NLRP3可能在EV71和CVA2引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用。

NLRP3是機(jī)體天然免疫反應(yīng)的重要組成部分，作為一種模式識(shí)別受體可有效地調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答[26]。本研究結(jié)果顯示EV71組和CVA2組小鼠腦組織NLRP3的表達(dá)升高，并且觀察到了NLRP3與病毒VP1的共定位。以上結(jié)果表明，EV71和CVA2均可感染神經(jīng)系統(tǒng)并且誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的活化，EV71和CVA2誘導(dǎo)小鼠腦組織NLRP3活化的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，NLRP3炎性小體的活化可能參與EV71和CVA2感染所致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。