自噬相關(guān)基因?qū)夏昱匀橄侔╊A(yù)后預(yù)測的價值

孟 軻，耿一萌，楊珍珍，馮 涵，李冰潔，馬 望

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

乳腺癌是威脅我國女性健康最主要的惡性腫瘤之一，其死亡率隨年齡的增長逐年升高，于60歲年齡組達(dá)到第一個高峰，并于85歲及以上年齡組達(dá)到最高峰[1]。老年患者因缺乏對乳腺癌的認(rèn)知且疏于乳房X線篩查或自檢[2]，一般在確診時已達(dá)晚期，加之老年患者依從性差，故治療效果并不理想。因此科學(xué)的風(fēng)險篩查是老年乳腺癌研究的重點(diǎn)。

細(xì)胞自噬又稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ARG)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，在細(xì)胞新陳代謝、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用；自噬異常與多種疾病密切相關(guān)，如癌癥和神經(jīng)退行性疾病等[3]。正常生理情況下自噬可以通過降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器等抑制腫瘤形成；然而一旦腫瘤形成，自噬作為保護(hù)細(xì)胞存活的機(jī)制，可以為多種癌細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤生長[4-6]。有研究[7]表明自噬基因ATG2B、ATG4D、ATG9B在乳腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織。據(jù)報道[8]Beclin-1是乳腺癌必需的自噬調(diào)節(jié)因子，在乳腺癌的發(fā)生過程中起腫瘤抑制作用，其等位基因的缺失可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的自噬缺陷有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示自噬在乳腺癌的發(fā)展過程中扮演著重要角色，ARG有可能是潛在的乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物。本研究探討了ARG與老年女性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

1.1.1乳腺癌病例信息 從TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)下載老年(60歲以上)女性乳腺癌患者504例的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)集。下載數(shù)據(jù)時TCGA數(shù)據(jù)庫更新至2019年9月10日。

1.1.2乳腺癌ARG數(shù)據(jù) 使用來自Ensemble數(shù)據(jù)庫的基因注釋文件處理原始數(shù)據(jù)。從人類自噬數(shù)據(jù)庫HADb(http://www.autophagy.lu/)中下載已知的232個ARG，與從TCGA中提取得到的老年女性乳腺癌患者ARG表達(dá)矩陣比對，最終確定222個ARG用于分析。

1.2 老年女性乳腺癌ARG相關(guān)風(fēng)險評分的構(gòu)建使用Caret包將病例按7∶3以無放回隨機(jī)抽樣的方式分為訓(xùn)練集(n=356)和驗證集(n=148)。乳腺癌患者總生存期定義為從隨機(jī)化開始至因任何原因死亡的時間。在訓(xùn)練集中，以222個ARG表達(dá)水平作為自變量，以總生存為結(jié)局，通過Cox回歸分析，使用AIC算法進(jìn)行優(yōu)化，篩選與老年女性乳腺癌總生存期密切相關(guān)(預(yù)后相關(guān))的ARG。以風(fēng)險評分的中位數(shù)作為臨界值，將乳腺癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，比較2組預(yù)后相關(guān)ARG的表達(dá)水平。使用DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)對篩選出來的預(yù)后相關(guān)ARG進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。ARG相關(guān)風(fēng)險評分=∑βn×基因n表達(dá)水平的平均值，其中β為預(yù)后相關(guān)ARG的Cox回歸系數(shù)。

1.3 基于ARG相關(guān)風(fēng)險評分的老年女性乳腺癌預(yù)后預(yù)測模型的構(gòu)建及評價在訓(xùn)練集中，以年齡(連續(xù)變量)、臨床分期(等級資料，同向賦值)、TNM分期(等級資料，同向賦值)作為協(xié)變量，以ARG相關(guān)風(fēng)險評分為自變量，以總生存為結(jié)局，進(jìn)行Cox回歸分析，構(gòu)建老年女性乳腺癌預(yù)后預(yù)測模型。在訓(xùn)練集和驗證集中，利用構(gòu)建的模型分別預(yù)測患者3、5、10 a生存概率，繪制時依ROC曲線，計算曲線下面積(AUC)，用于評估模型的預(yù)測能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用R Studio 1.2.1335進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 訓(xùn)練集和驗證集中乳腺癌病例的一般信息見表1。

2.2 老年女性乳腺癌ARG相關(guān)風(fēng)險評分的構(gòu)建單因素Cox回歸分析得到23個ARG，經(jīng)多因素Cox回歸分析，AIC優(yōu)化，最終納入7個老年女性乳腺癌預(yù)后相關(guān)ARG(表2)用于構(gòu)建風(fēng)險評分。以風(fēng)險評分的中位數(shù)作為界值，將乳腺癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組,2組7個ARG表達(dá)的熱圖見圖1。

2.3 老年女性乳腺癌預(yù)后相關(guān)ARG的功能富集分析GO功能富集分析結(jié)果表明，這7個ARG參與的生物學(xué)過程主要有巨噬細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)定位至前自噬體結(jié)構(gòu)、自噬等；涉及的細(xì)胞成分主要有內(nèi)體膜回收；涉及的分子功能主要有半胱氨酸肽酶活性。KEGG通路分析結(jié)果表明這些基因與自噬(動物)等通路顯著相關(guān)。

2.4 基于ARG相關(guān)風(fēng)險評分的老年女性乳腺癌預(yù)后預(yù)測模型的預(yù)測價值經(jīng)多因素Cox回歸分析，在調(diào)整了年齡、臨床分期、T分期、N分期和M分期等因素后，得到基于ARG相關(guān)風(fēng)險評分的預(yù)測模型，各變量參數(shù)見表3。

在訓(xùn)練集和驗證集中，利用Cox回歸模型對患者3、5、10 a生存概率進(jìn)行預(yù)測，利用預(yù)測值和實(shí)際隨訪結(jié)果繪制ROC曲線，結(jié)果見圖2。

表1 乳腺癌病例的一般信息 例

表2 老年女性乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)ARG Cox回歸篩選結(jié)果

圖1 低風(fēng)險組和高風(fēng)險組7個預(yù)后相關(guān)ARG表達(dá)的熱圖

表3 基于ARG相關(guān)風(fēng)險評分的預(yù)測模型各變量參數(shù)

上：訓(xùn)練集；下：驗證集

3 討論

自噬是真核細(xì)胞中高度保守的進(jìn)化過程，參與了一系列細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持?；贏RG的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)已在包括漿液性卵巢癌、結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中得到報道[9-11]。研究[12]表明，自噬蛋白與乳腺癌預(yù)后關(guān)系密切。推測ARG在老年乳腺癌預(yù)后評估中可能具有廣闊的應(yīng)用前景。

我們基于TCGA和HADb數(shù)據(jù)庫，利用Cox回歸模型，篩選出7個老年女性乳腺癌預(yù)后相關(guān)ARG，并利用于這7個ARG構(gòu)建了風(fēng)險評分。這7個ARG中，自噬相關(guān)基因4A(autophagy related gene 4A，ATG4A)和ATG4D在自噬體形成過程中起到關(guān)鍵作用[13]，ATG4A對于維持具有癌癥干細(xì)胞特性的亞群以及調(diào)節(jié)體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞的致瘤性是必不可少的[14]，而ATG4D可以在結(jié)直腸癌的發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用[15]。ATG9B普遍表達(dá)于乳腺組織中，其表達(dá)缺失可改變?nèi)橄侔┲凶允杉?xì)胞運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制，從而加速乳腺癌的進(jìn)展[16]。NKX2-3(NK2 transcription factor related,locus 3)是NKX家族的重要成員，有研究[17]表明其通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。有研究[18]發(fā)現(xiàn),絲裂原蛋白活化激酶9(mitogen-activated protein kinase 9，MAPK9)缺失的乳腺腫瘤模型小鼠的腫瘤潛伏期縮短，腫瘤多樣性和基因組不穩(wěn)定性增加。干擾素γ(interferon gamma，IFNG)作為腫瘤免疫監(jiān)視和腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)劑，在乳腺癌組織中的表達(dá)水平略高于其鄰近的非癌組織[19-20]。囊泡相關(guān)膜蛋白3(vesicle-associated membrane protein 3，VAMP3)可以介導(dǎo)含有ATG9和ATG16L1的囊泡之間的異型融合，這與自噬體形成過程密切相關(guān)[21],也進(jìn)一步提示風(fēng)險評分中的各ARG存在內(nèi)部聯(lián)系；此外，有研究[22]表明富含膽固醇的膜微結(jié)構(gòu)缺陷可促使VAMP3所介導(dǎo)的自噬體生成及乳腺癌多柔比星耐藥的發(fā)生。

我們利用Cox回歸分析，建立了一個基于ARG相關(guān)風(fēng)險評分，并經(jīng)年齡、臨床分期、T分期、N分期、M分期調(diào)整的老年女性乳腺癌預(yù)后預(yù)測模型。ROC分析結(jié)果表明，該模型預(yù)測老年女性乳腺癌3、5及10 a生存率的準(zhǔn)確性良好，有助于高?；颊叩淖R別及建立更精確的個體化治療策略。

本研究也存在一些局限性。因ARG的臨床檢測較少，缺少足夠的病例，不能驗證該模型的實(shí)際預(yù)測能力；此外，風(fēng)險評分中包含的ARG的相互關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

綜上，我們建立了一個包括7個ARG的老年女性乳腺癌預(yù)后預(yù)測的方法，但仍需前瞻性臨床試驗進(jìn)一步驗證自噬相關(guān)指標(biāo)在預(yù)測老年女性乳腺癌預(yù)后方面的臨床價值。