組織因子途徑抑制物2對(duì)SD乳鼠心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞功能的影響

洪 晉，黃玉起，白中樂(lè)，朱記法，張振宇，趙 文，劉獻(xiàn)志，董建增

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 4)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科 北京 100029

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見(jiàn)的心律失常之一，在全球范圍內(nèi)造成巨大醫(yī)療負(fù)擔(dān)，且發(fā)病率逐年增加[1]。心房纖維化是AF發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是AF進(jìn)展和維持的重要因素[2]，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)積聚、正常組織結(jié)構(gòu)和功能破壞。心臟ECM的主要成分是膠原纖維[2]；基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinase，MMP)以MMP-9和MMP-2為代表，在心臟重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑[4]。迄今為止有關(guān)TFPI-2對(duì)心血管疾病影響的研究主要集中在動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域：過(guò)表達(dá)TFPI-2能抑制斑塊內(nèi)MMP水解活化[5]，部分敲除TFPI-2可促進(jìn)斑塊局部MMP表達(dá)[6]，TFPI-2還能影響動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡[7]，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。本研究從細(xì)胞和分子層面著手，探索TFPI-2對(duì)參與心房纖維化的心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞功能的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1病例來(lái)源 2018年10月至2019年8月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療的孤立性AF患者15例(AF組)，排除任何可能導(dǎo)致AF的心血管疾病如高血壓、冠心病、瓣膜病、先心病、心肌病、心包疾病等，排除可導(dǎo)致AF的其他系統(tǒng)疾病如甲亢、糖尿病、肺部疾病、自身免疫疾病等，排除其他影響TFPI-2水平的疾病或狀態(tài)如炎癥、腫瘤、肝腎功能損傷、妊娠等。所有患者均無(wú)其他合并癥或既往手術(shù)史。選取15名同期體檢健康者作為正常對(duì)照。入組后均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)(審批號(hào)：2018-KY-38)。

1.1.2動(dòng)物來(lái)源 SPF級(jí)出生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001。

1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自以色列Biological Industries公司，青鏈霉素、5-溴脫氧尿苷(5-BrdU)、DAPI均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司，Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Worthington公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，Vimentin抗體購(gòu)自美國(guó)Signalway抗體公司，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體、Ⅲ型膠原抗體、Ⅰ型膠原抗體、MMP-2抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，大鼠TFPI-2重組蛋白(rTFPI-2)、TFPI-2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢Cloud-Clone公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，p-Erk1/2抗體、t-Erk1/2抗體、MMP-9抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，PARP抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，GAPDH抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 AF患者和正常對(duì)照血清TFPI-2水平檢測(cè)抽取AF患者和正常對(duì)照靜脈血標(biāo)本4 mL，采用ELISA法檢測(cè)血清TFPI-2水平。

1.4 原代心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞的分離與鑒定取SD乳鼠消毒后取出心臟，D-Hanks液清洗。沿房室溝剪下心房并剪碎至約1 mm3，1 g/L胰蛋白酶4 ℃消化過(guò)夜。吸棄胰蛋白酶液，加入0.8 g/L Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴消化至溶液變渾濁，取消化液加入等量含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的完全培養(yǎng)基(以青鏈霉素處理的DMEM高糖培養(yǎng)基)。重復(fù)直至組織塊消化完全。200目濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞混懸液，離心棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)10% FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。鋪板后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，心房成纖維細(xì)胞貼壁，而心房肌細(xì)胞不貼壁，利用差速貼壁法將兩種細(xì)胞分開(kāi)。將含心房肌細(xì)胞的培養(yǎng)液吸入一新培養(yǎng)皿，同時(shí)加入10 g/L 5-BrdU，原培養(yǎng)皿(含心房成纖維細(xì)胞)中加入等量含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取3代以內(nèi)心房成纖維細(xì)胞和原代心房肌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)胞接種于24孔板，貼壁培養(yǎng)到細(xì)胞融合度達(dá)60%，預(yù)冷甲醇固定15 min；體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100 處理10 min后加體積分?jǐn)?shù)5%FBS室溫封閉30 min，加體積分?jǐn)?shù)5%FBS稀釋的Vimentin抗體(1∶200稀釋)或α-SMA抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過(guò)夜；用預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween-20漂洗2次，再用預(yù)冷PBS漂洗；加入PBS配制的熒光二抗(1∶200稀釋)室溫避光孵育1 h，預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween-20漂洗2次，再用預(yù)冷PBS漂洗。DAPI染核30 min后用預(yù)冷PBS漂洗。熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.5 rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞增殖的影響調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，將心房成纖維細(xì)胞鋪于96孔板，每孔100 μL。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80%，更換含不同質(zhì)量濃度(0、50、100、200 μg/L)rTFPI-2的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48 h后加入CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)值，以評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力。根據(jù)該結(jié)果選擇合適的rTFPI-2濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞遷移的影響將約5×104個(gè)心房成纖維細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸、轉(zhuǎn)移到Transwell小室上室(膜孔直徑為8.0 μm)，分別將不含rTFPI-2(空白對(duì)照組)或含有100 μg/L rTFPI-2(rTFPI-2處理組)的無(wú)血清培養(yǎng)基加入下室培養(yǎng)24 h。取出小室，用冰甲醇4 ℃固定30 min，室溫下用結(jié)晶紫染色30 min，輕柔沖洗濾膜后晾干。顯微鏡(×100)下拍攝濾膜下室面，取6個(gè)視野，使用Image J軟件計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞凋亡的影響將心房成纖維細(xì)胞鋪于6孔板中，37 ℃孵育至細(xì)胞融合度約70%，更換不含rTFPI-2(空白對(duì)照組)或含100 μg/L rTFPI-2(rTFPI-2處理組)的完全培養(yǎng)基孵育48 h。用不含EDTA的胰蛋白酶處理細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌兩次，2 000×g離心5 min。將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC，并加入5 μL PI，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。同法檢測(cè)心房肌細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞及心房肌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞同1.7分組處理，48 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白并通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組樣品上樣20 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)印于NC膜，使用50 g/L脫脂牛奶低速搖床室溫封閉2 h。加一抗(p-Erk1/2、t-Erk1/2、MMP-9、MMP-2、PARP、Ⅲ型和Ⅰ型膠原抗體均按1∶1 000稀釋，GAPDH抗體按1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育2 h。洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影。使用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。計(jì)算目的條帶和內(nèi)參(GAPDH)條帶灰度值的比值，以實(shí)驗(yàn)組此比值與空白對(duì)照組均值的比值為實(shí)驗(yàn)組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或精確概率法比較正常對(duì)照組和AF組臨床資料及血清TFPI-2水平的差異，采用單因素方差分析探討不同濃度rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞增殖的影響，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較空白對(duì)照組與rTFPI-2處理組心房成纖維細(xì)胞遷移、凋亡和相關(guān)蛋白表達(dá)的差異以及心房肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 AF組和正常對(duì)照組臨床資料、血清TFPI-2水平比較兩組在年齡、性別、BMI、血壓等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而AF患者血清TFPI-2水平低于正常對(duì)照(表1)。

表1 兩組臨床資料、血清TFPI-2水平的比較(n=15)

2.2 原代心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞鑒定本研究采用Vimentin抗體鑒定心房成纖維細(xì)胞，α-SMA抗體鑒定心房肌細(xì)胞，結(jié)果見(jiàn)圖1。兩種細(xì)胞純度均在90%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞免疫熒光鑒定(×200)

2.3 rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞增殖的影響不同濃度rTFPI-2處理后心房成纖維細(xì)胞增殖活性受到不同程度抑制，且隨rTFPI-2濃度升高，抑制作用增強(qiáng)(表2)，rTFPI-2濃度為100 μg/L時(shí)抑制效果顯著，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)rTFPI-2 濃度取100 μg/L。

表2 不同濃度rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞增殖的影響(n=3)

2.4 rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞遷移、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖2、表3。與空白對(duì)照組相比，rTFPI-2處理組遷移細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率升高，p-Erk1/2、MMP-9和MMP-2表達(dá)降低，PARP表達(dá)升高，Ⅲ型、Ⅰ型膠原表達(dá)下降。

1：空白對(duì)照組；2：rTFPI-2處理組

表3 rTFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞遷移、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.5 rTFPI-2對(duì)心房肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，rTFPI-2處理組心房肌細(xì)胞凋亡率及PARP蛋白表達(dá)無(wú)顯著改變，但Ⅲ型、Ⅰ型膠原表達(dá)下降(圖3、表4)。

1：空白對(duì)照組；2：rTFPI-2處理組

表4 rTFPI-2對(duì)心房肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

3 討論

心房纖維化與AF密切相關(guān)，無(wú)論是器質(zhì)性心臟病所致AF還是孤立性AF，心房組織標(biāo)本中均存在心房纖維化[8]。心房纖維化是心房纖維組織形成及重新分布的過(guò)程，涵蓋正常細(xì)胞丟失和結(jié)締組織增生兩方面[2]，具體包括心房成纖維細(xì)胞增殖遷移、心房肌細(xì)胞凋亡丟失、ECM改建[9]。本研究發(fā)現(xiàn)AF患者血清TFPI-2較正常人降低，提示TFPI-2可能在AF發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用；后續(xù)結(jié)果證實(shí)TFPI-2可抑制心房成纖維細(xì)胞增殖及遷移，并促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞凋亡，從而減少心房成纖維細(xì)胞數(shù)量，有利于限制心房結(jié)締組織增生、減少房?jī)?nèi)折返發(fā)生[10]，最終可能預(yù)防或延緩AF發(fā)生。

既往研究[11]表明細(xì)胞增殖及遷移可由p-Erk1/2調(diào)控，TFPI-2可降低乳腺癌細(xì)胞p-Erk1/2表達(dá)從而抑制其增殖及遷移[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2可抑制心房成纖維細(xì)胞增殖及遷移，可能與TFPI-2介導(dǎo)的p-Erk1/2表達(dá)下調(diào)相關(guān)。同時(shí)細(xì)胞遷移過(guò)程需要MMP參與[2]，而文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道TFPI-2能抑制MMP水解活化。本研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2能減少M(fèi)MP-9和MMP-2表達(dá)，推測(cè)是其抑制心房成纖維細(xì)胞遷移的重要機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)在TFPI-2作用下，心房成纖維細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)促凋亡蛋白PARP表達(dá)上調(diào)，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[13]結(jié)果一致。

另外，本研究結(jié)果顯示雖然TFPI-2可促進(jìn)心房成纖維細(xì)胞凋亡，但并不增加心房肌細(xì)胞凋亡，而心房肌細(xì)胞凋亡是心房重構(gòu)的重要一環(huán)[2,9]。心房肌細(xì)胞為不可分裂細(xì)胞，凋亡越少則存活越多，TFPI-2不增加心房肌細(xì)胞凋亡有助于維持心房正常結(jié)構(gòu)。這可能與TFPI-2對(duì)心房肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP表達(dá)無(wú)顯著影響有關(guān)。此外，有研究[14]發(fā)現(xiàn)PARP可抑制心肌細(xì)胞收縮，推測(cè)TFPI-2可能不會(huì)對(duì)心房肌細(xì)胞收縮功能產(chǎn)生影響，這有助于心房正常功能維持。

除以上細(xì)胞組分外，心房纖維化的過(guò)程還需要非細(xì)胞組分參與，其中以膠原纖維為代表。本研究發(fā)現(xiàn)TFPI-2處理后心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞產(chǎn)生Ⅲ型膠原和Ⅰ型膠原減少，這兩種膠原是心臟ECM的主要成分[2]。在心肌細(xì)胞凋亡局部，纖維化的產(chǎn)生不僅需要膠原的填充，同時(shí)需要相協(xié)調(diào)的膠原降解，此時(shí)MMP及其抑制物起重要作用[2]。本研究結(jié)果顯示，TFPI-2可抑制心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞MMP-9和MMP-2表達(dá)，從而抑制ECM改建，具有抗心房纖維化作用。

綜上，TFPI-2對(duì)心房成纖維細(xì)胞和心房肌細(xì)胞存在差異作用，TFPI-2可抑制心房成纖維細(xì)胞增殖及遷移，促進(jìn)其凋亡，但不增加心房肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與TFPI-2對(duì) p-Erk1/2、MMP-9、MMP-2、PARP的調(diào)控有關(guān)，TFPI-2還能抑制膠原合成，有可能通過(guò)多重機(jī)制產(chǎn)生抗心房纖維化作用，具有預(yù)防及治療AF的潛在價(jià)值。