具核梭桿菌對(duì)炎癥小體NLRP3的誘導(dǎo)作用對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存期的影響

張哲源，劉怡文，付 臻，楊 洪，張 寧，梁夢(mèng)夏，李婉瑩，孔金玉，孫 蔚，楊海軍，

張耀文6，7)，周福有1,6，8)

1)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院；河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽(yáng) 471003 2)河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院影像科 河南安陽(yáng)455000 3)河南科技大學(xué)體育學(xué)院 河南洛陽(yáng) 471003 4)河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡診療中心 河南安陽(yáng) 455000 5)河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院病理科 河南安陽(yáng) 455000 6)河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南安陽(yáng) 455000 7)河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院放療科 河南安陽(yáng) 455000 8)河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院胸外科 河南安陽(yáng) 455000

食管癌發(fā)病率與病死率極高，我國(guó)以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)為主。目前ESCC的治療主要有手術(shù)、放化療及免疫治療等，但效果仍不理想[1]。研究[2]表明，多種病原微生物長(zhǎng)期定植于機(jī)體可促進(jìn)ESCC進(jìn)展。具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn)n)為毒力最強(qiáng)的口腔致病菌之一，與ESCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其具體致病機(jī)制尚不完全明確。研究[3]顯示，病原微生物可通過(guò)調(diào)控宿主免疫應(yīng)答引發(fā)炎癥反應(yīng)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，為自身長(zhǎng)期定植提供有利條件。炎癥反應(yīng)由多種炎癥小體誘發(fā)，其中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)是炎癥小體中關(guān)鍵的調(diào)控蛋白之一[4]，NLRP3可通過(guò)維持腫瘤細(xì)胞干性，促進(jìn)多種腫瘤惡性進(jìn)展并協(xié)助其化療抵抗[5]。因此推測(cè)Fn可能通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，促進(jìn)ESCC惡性進(jìn)展。本研究首先檢測(cè)Fn感染后ESCC細(xì)胞對(duì)順鉑(cis-diamine dichloroplatinum，CDDP)與紫杉醇(pachitaxel，PTX)的敏感性及NLRP3表達(dá)的變化，初步分析Fn誘導(dǎo)ESCC中NLRP3表達(dá)對(duì)CDDP與PTX化療的影響,并通過(guò)檢測(cè)ESCC組織中Fn感染及NLRP3蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析Fn對(duì)NLRP3的誘導(dǎo)效應(yīng)與患者病理特征及生存期的關(guān)系，為ESCC治療提供新思路和治療手段。

1 材料與方法

1.1 ESCC及癌旁正常組織的來(lái)源本研究于術(shù)前獲得患者知情同意，經(jīng)河南科技大學(xué)附屬安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，共納入2015年1至12月手術(shù)切除的213例ESCC及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①治療性ESCC切除術(shù)后。②患者術(shù)前無(wú)呼吸系統(tǒng)等其他疾病。③術(shù)后病理診斷明確為ESCC，且未合并其他腫瘤。④病例資料信息全面。⑤隨訪(fǎng)時(shí)間5 a。⑥術(shù)后常規(guī)“CDDP+PTX”(TP)方案化療，且未接受放療或免疫治療。病例的臨床病理特征如下：男134例，女79例；年齡<60歲98例，≥60歲115例；吸煙106例，不吸煙107例；飲酒102例，不飲酒111例；低分化32例，中分化99例，高分化82例；侵及外膜146例，未侵及外膜67例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移99例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移114例；臨床分期為Ⅰ/Ⅱ期123例，Ⅲ/Ⅳ期90例。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器ESCC細(xì)胞系KYSE30及 KYSE150(上海博谷生物科技有限公司)，F(xiàn)n菌株(ATCC 2558，美國(guó)路易斯維爾大學(xué))。CDDP與PTX(美國(guó)Selleck Chemicals公司)。腦心浸液培養(yǎng)基(法國(guó)梅里埃公司)；無(wú)菌脫纖維綿羊血、DAB顯色液、pH 6.0檸檬酸抗原修復(fù)液(北京索萊寶科技有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；SP法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；NLRP3及GAPDH兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；RNAscope試劑盒及Fn 16S rRNA特異探針(美國(guó)Advanced Cell Diagnostics公司)；山羊抗兔IgG和BCA蛋白定量試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)；ECL發(fā)光顯影液(美國(guó)Invitrogen公司)。NLRP3 上游引物5’-CGTGAGTC CCATTAAGATGGAGT-3’，下游引物5’-CTCGA CAGTGGATATAGAACAGA-3’，產(chǎn)物大小191 bp；GAPDH上游引物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，產(chǎn)物大小138 bp(上海生工生物工程股份有限公司)。反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)及熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；厭氧工作站(美國(guó)COY公司)。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組Fn在腦心浸液培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)5%無(wú)菌脫纖維綿羊血、10 g/L氯化血紅蛋白和1 g/L維生素K1)中，于37 ℃體積分?jǐn)?shù)85%N2、10%H2和5%CO2的厭氧工作站常規(guī)培養(yǎng)。利用革蘭染色法及哥倫比亞血瓊脂板檢測(cè)Fn純度，選取活力較好的Fn菌液[OD(600 nm)=1～2]，待KYSE30及KYSE150細(xì)胞密度為60%～70%時(shí)，以感染復(fù)數(shù)=10將菌液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，分4組，分別感染12、24、48及72 h。另設(shè)未感染細(xì)胞作為對(duì)照。

1.4 KYSE30、KYSE150細(xì)胞CDDP與PTX的半數(shù)抑制濃度(IC50)測(cè)定采用CCK-8法。96孔板中每孔接種100 μL細(xì)胞懸液(每孔1 000個(gè)細(xì)胞)，置于培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2)。每種細(xì)胞均設(shè)置1個(gè)對(duì)照孔及不同濃度的實(shí)驗(yàn)孔(藥物濃度從0.25 mg/L開(kāi)始，0.25 mg/L遞增，直至30.00 mg/L)，按上述濃度分別加入CDDP與PTX，培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，1 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度并計(jì)算IC50[6]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 各組KYSE30、KYSE150 細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)的檢測(cè)提取各組KYSE30及KYSE150細(xì)胞新鮮蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)濃度并定量。每泳道上樣量為30 μg總蛋白，蛋白SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含50 g/L脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，加入NLRP3(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶2 000稀釋)抗體4 ℃孵育過(guò)夜。加入山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并應(yīng)用Image Lab軟件進(jìn)行條帶灰度值測(cè)定，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 各組KYSE30、KYSE150 細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟參考文獻(xiàn)[7]。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為5×RT緩沖液4 μL、RT酶混合液1 μL、引物混合液1 μL、RNA模板2 μL，加無(wú)RNA酶水至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃15 min，98 ℃ 5 min。qRT-PCR反應(yīng)體系為2×qRT-PCR混合液10 μL，20 μmol/L上下游引物各0.1 μL，cDNA 模板2 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共 40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算NLRP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 ESCC及癌旁正常組織中Fn感染的檢測(cè)取石蠟包埋的ESCC組織切片(片厚2.5 μm)，常規(guī)脫蠟，RNAscope 雙氧水孵育10 min，靶標(biāo)修復(fù)試劑修復(fù)15 min，RNAscope 蛋白酶孵育10 min，加入Fn探針40 ℃雜交2 h；RNAscope顯色液1～6號(hào)試劑，分別于40 ℃孵育30、15、30、15 min，室溫孵育30、15 min；RED工作液室溫孵育10 min，蘇木精復(fù)染2 min，封片。400倍鏡下取5個(gè)視野進(jìn)行觀察。參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行判定：細(xì)胞中單獨(dú)的紅色顆?！?個(gè)為Fn感染陽(yáng)性細(xì)胞；每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞比例均>30%為陽(yáng)性標(biāo)本。

1.8 ESCC及癌旁正常組織中NLRP3蛋白表達(dá)的檢測(cè)取石蠟包埋的ESCC組織連續(xù)切片(片厚2.5 μm)，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸高溫修復(fù)20 min，過(guò)氧化物酶阻斷劑避光封閉10 min，山羊血清封閉30 min，NLRP3抗體(1∶200稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，山羊抗鼠/兔聚合物室溫孵育30 min，SP試劑封閉10 min，DAB顯色8 min，鏡下監(jiān)測(cè)顯色結(jié)果，蘇木精復(fù)染8 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明10 min，中性樹(shù)膠封片。以已知NLRP3陽(yáng)性表達(dá)的組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照；PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。400倍鏡下取5個(gè)視野進(jìn)行觀察。胞漿出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為NLRP3陽(yáng)性表達(dá)。按染色強(qiáng)度評(píng)分：0分，未著色；1分，淺黃色著色；2分，棕黃色著色；3分，棕褐色著色。按染色面積評(píng)分：每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞比例均<5%為0分，5%～為1分，25%～為2分，50%～為3分，≥75%為4分。取2項(xiàng)評(píng)分之積：0分為陰性，≥1分為陽(yáng)性[9]。將RNAscope及免疫組化結(jié)果2張連續(xù)切片中Fn及NLRP3同時(shí)判定為陽(yáng)性的組織標(biāo)本定義為Fn誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)陽(yáng)性組，以Fn+NLRP3陽(yáng)性組表示；不滿(mǎn)足2張連續(xù)切片同時(shí)陽(yáng)性的為陰性組，以Fn+NLRP3陰性組表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同組間KYSE30和KYSE150細(xì)胞CDDP與PTX 24 hIC50、NLRP3蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。ESCC及癌旁正常組織中Fn感染率及NLRP3陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用McNemar檢驗(yàn)，ESCC組織中Fn感染與NLRP3表達(dá)的一致性分析采用Cohen′sKappa檢驗(yàn)。Fn+NLRP3陰性和陽(yáng)性組患者臨床病理特征的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法繪制2組的生存曲線(xiàn)并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。生存時(shí)間為入院至最后1次隨訪(fǎng)或死亡(隨訪(fǎng)時(shí)間為60個(gè)月)的時(shí)間，刪失數(shù)據(jù)為隨訪(fǎng)至60個(gè)月仍存活的患者，未刪失數(shù)據(jù)為由ESCC導(dǎo)致的死亡患者。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組KYSE30及KYSE150 細(xì)胞CDDP與PTX 24 hIC50的比較結(jié)果見(jiàn)表1。與Fn未感染組相比，各Fn感染組KYSE30及KYSE150細(xì)胞CDDP與PTX 24 hIC50均增高，且IC50隨Fn感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。

表1 各組KYSE30及KYSE150細(xì)胞CDDP與PTX 24 h IC50的比較 mg/L

2.2 各組KYSE30及KYSE150細(xì)胞中NLRP3蛋白及mRNA表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。與Fn未感染組相比，各Fn感染組KYSE30及KYSE150 細(xì)胞中NLRP3蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均增高，且NLRP3蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均隨Fn感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。

2.3 ESCC及癌旁正常組織中Fn感染與NLRP3的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表3～5。ESCC組織中Fn感染與NLRP3表達(dá)具有一致性。

圖1 各組KYSE30及KYSE150細(xì)胞中NLRP3蛋白的表達(dá)

表2 各組KYSE30及KYSE150細(xì)胞中NLRP3蛋白及mRNA表達(dá)的比較

表3 ESCC及癌旁正常組織中Fn感染率的比較 例

表4 ESCC及癌旁正常組織中NLRP3陽(yáng)性表達(dá)率的比較 例

表5 ESCC組織中Fn感染與NLRP3表達(dá)的一致性 例

2.4 Fn+NLRP3陰性和陽(yáng)性組病例臨床病理特征的比較Fn+NLRP3陰性組127例，陽(yáng)性組86例。Fn+NLRP3陽(yáng)性組患者中男性、吸煙、飲酒者居多，且多為低分化，腫瘤浸潤(rùn)程度較深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加，臨床分期多為Ⅲ/Ⅳ期(表6)。

表6 Fn+NLRP3陰性和陽(yáng)性組病例臨床病理特征的比較 例

2.5 Fn+NLRP3陰性和陽(yáng)性組患者預(yù)后的比較兩組的生存曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。Fn+NLRP3陽(yáng)性組中位生存時(shí)間(四分位數(shù))為19.00(9.00，35.00)個(gè)月，低于陰性組的40.00(20.00，-)個(gè)月(χ2=43.027，P<0.001)。

圖2 Fn+NLRP3陰性組與陽(yáng)性組ESCC患者術(shù)后5 a生存曲線(xiàn)

3 討論

ESCC是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率與病死率較高。隨著臨床醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，ESCC的治療效果明顯好轉(zhuǎn)，但預(yù)后仍較差[1]。因此，尋找精準(zhǔn)的早期指標(biāo)、有效的預(yù)防措施及靶向治療方法，非常重要。Fn為革蘭陰性厭氧菌，廣泛定植于口腔和消化道內(nèi)，近年來(lái)被認(rèn)定為具有毒性的條件致病菌，可促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌、ESCC以及結(jié)腸癌等多種腫瘤的惡性進(jìn)展[10]。本研究證實(shí)ESCC組織中Fn感染率高于癌旁正常組織，提示癌組織的微環(huán)境更適于Fn定植，但其具體致病機(jī)制尚未完全明確。

資料[4]顯示，宿主抵抗病原微生物入侵的第一道保護(hù)屏障為機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)，其主要成分為炎癥復(fù)合體，而NLRP3是炎癥復(fù)合體家族中重要成員之一，主要在胞漿監(jiān)測(cè)危險(xiǎn)信號(hào)，識(shí)別各種病原微生物及其代謝產(chǎn)物，激活Caspase-1，使IL-1β等促炎因子成熟并釋放到胞外，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并引起炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及抗凋亡能力，且降低其對(duì)藥物的敏感性。病原微生物對(duì)NLRP3炎癥小體的活化作用參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。幽門(mén)螺桿菌可活化胃癌及胃黏膜細(xì)胞中NLRP3蛋白，導(dǎo)致髓源性抑制細(xì)胞募集與增殖，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲能力及抗凋亡能力[11]；EB病毒可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞NLRP3表達(dá)，促進(jìn)其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并顯著縮短患者生存期[12]；HPV可激活宮頸癌細(xì)胞NLRP3蛋白，促進(jìn)腫瘤惡性增殖和血管生成[13]。同時(shí)NLRP3在多種腫瘤的藥物抵抗中也發(fā)揮著重要作用。如淋巴瘤細(xì)胞中NLRP3炎癥小體通路的活化可促進(jìn)其抗凋亡能力，降低化療藥物的療效[14]；胰腺癌細(xì)胞中NLRP3炎癥小體通路被激活，可引起胰腺癌細(xì)胞分泌IL-1β增多，干性增強(qiáng)，導(dǎo)致治療抵抗[15]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Fn感染時(shí)間的延長(zhǎng)，ESCC細(xì)胞中NLRP3表達(dá)量逐漸增高，且CDDP與PTX化療的敏感性逐漸減弱，提示NLRP3在Fn感染引起的化療抵抗中發(fā)揮重要作用，表明Fn可通過(guò)誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中NLRP3表達(dá)，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，協(xié)助腫瘤細(xì)胞化療抵抗。

本研究中ESCC組織免疫組化結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即ESCC患者癌組織中NLRP3表達(dá)與Fn感染具有一致性，而癌旁正常組織中二者多為陰性表達(dá)，提示Fn可通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)，為自身長(zhǎng)期定植提供有利條件。本研究還發(fā)現(xiàn)Fn+NLRP3陽(yáng)性組患者中男性、吸煙、飲酒者居多，提示長(zhǎng)期吸煙、飲酒的男性患者口腔環(huán)境更加惡劣，F(xiàn)n更容易感染并定植，從而誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)。且隨腫瘤分化程度降低，陽(yáng)性組患者比例增加，提示Fn對(duì)NLRP3的誘導(dǎo)效應(yīng)與腫瘤的惡性程度有關(guān)。且陽(yáng)性組患者腫瘤組織浸潤(rùn)程度較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加及臨床分期多為Ⅲ/Ⅳ期，提示該效應(yīng)促進(jìn)了ESCC的惡性增殖及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，接受術(shù)后常規(guī)TP方案化療的ESCC患者中，F(xiàn)n+NLRP3陽(yáng)性組患者中位生存時(shí)間縮短，提示Fn可通過(guò)誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中NLRP3表達(dá)削弱TP方案化療療效，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，而有效清除Fn并抑制NLRP3表達(dá)可延長(zhǎng)ESCC患者生存期。

由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的演變過(guò)程，F(xiàn)n的具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討，但打破Fn在宿主體內(nèi)持久定植的現(xiàn)狀，并有效抑制NLRP3，對(duì)于積極有效地延緩ESCC化療抵抗并延長(zhǎng)患者生存期具有非常重要的意義。