環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear用于HE染色效果分析

張淑艷，康林，張秀智，徐明堂，馬曉麗

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法是石蠟切片技術(shù)中較常用的染色法之一，蘇木精（H）染液主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)以及細胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍色，伊紅（E）主要使細胞質(zhì)以及細胞外基質(zhì)中的成分著紅色［1］。及時、準確地固定、透明、脫蠟處理是HE 染色過程中的關(guān)鍵步驟，目前病理學(xué)界中主要采用甲醛和二甲苯來處理標本切片，但有研究指出甲醛和二甲苯具有刺激性，病理工作者又需要長期接觸這兩種試劑，長此以往容易對病理工作者的身體健康造成嚴重影響［2-3］。因此，尋找環(huán)保、安全性高的固定液和透明脫蠟液就顯得尤為重要。本研究運用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Vanclear共同代替甲醛和二甲苯處理切片，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集河北省人民醫(yī)院2018 年1 月至2019 年1 月期間送檢的腦組織（12 例顳葉癲癇病人病變組織）、脾組織（18 例脾功能亢進病人病變組織）、骨髓瘤組織（22 例）、淋巴結(jié)組織（50 例肺癌/胃癌手術(shù)中切除的淋巴結(jié)標本）、淋巴瘤組織（10 例）、乳腺纖維腺瘤組織（62 例）、宮頸腺癌組織（26 例）、子宮平滑肌瘤組織（74 例）、慢性宮頸炎組織（102例）、胎盤組織（35 例子癇前期病人）、脂肪瘤組織（57 例），病人年齡范圍18.7～70.5 歲，年齡（41.8±5.2）歲。同一部位標本各取材兩塊，采用抽簽法隨機分為A 組和B 組。A 組采用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear 制作HE 切片468 張，B 組采用傳統(tǒng)甲醛和二甲苯制作HE切片468張，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑與設(shè)備聚羥基丙烯酸固定液購自于廣州艾發(fā)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)工程有限公司，Van-clear 環(huán)保透明脫蠟劑購自于上海創(chuàng)訊醫(yī)療器械有限公司，甲醛溶液購自于上海一基實業(yè)有限公司，二甲苯購自于上海一基實業(yè)有限公司，蘇木精染液、伊紅染液購自于上海謹生生物科技有限公司。SAKURA Tissue Tek VIP-5全自動密閉式組織脫水機、DRS-2000J-D2全自動染色機產(chǎn)自于日本櫻花檢驗儀器株式會社，Thermo HM325 輪轉(zhuǎn)石蠟切片機產(chǎn)自于德國Thermo公司，切片厚度為2～3μm，BJ43-PAS8000病理圖像分析儀產(chǎn)自于北京市中西集團公司，OLYMPUSB×51熒光顯微鏡產(chǎn)自于日本奧林巴斯株式會社。

1.3 組織處理和制作切片A 組采用4%的中性緩沖甲醛液固定，經(jīng)全自動組織脫水機脫水、二甲苯透明、浸蠟等處理，B 組采用聚羥基丙烯酸固定液固定，經(jīng)全自動組織脫水機脫水、Van-clear 透明、浸蠟等處理。過程中注意固定液的量需達到標本體積的10倍，標本固定12 h后取材。

1.4 HE 染色A、B 組標本分別經(jīng)過二甲苯或Vanclear 脫蠟處理之后，采用100%乙醇×2 各3 min，流水沖洗；蘇木精染色12 min，流水沖洗；1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗；1%氨水返藍，水洗；1%醇溶性伊紅染色1 min，70%乙醇各30 s，95%乙醇×2 各30 s，100%乙醇×2 各2 min，Van-clear 或二甲苯×2 各2 min，最后中性樹膠封固。操作過程中相關(guān)病理組織處理流程和時間均嚴格按照中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)會病理技術(shù)的相關(guān)規(guī)定和流程進行［4］，兩組組織切片的HE 染色均在相同的條件中進行，以減少研究結(jié)果的誤差，提高可信度。

1.5 HE 結(jié)果判斷和評分根據(jù)中國常規(guī)病理切片質(zhì)控中心推薦的質(zhì)控評分標準［5］判斷兩組切片HE染色情況，判斷的內(nèi)容主要包括切片的脫蠟度、透明度、著色度、顏色鮮亮度等，采用優(yōu)、良、中、差對切片的染色結(jié)果進行評定：優(yōu)，切片的脫蠟度好、透明度好、著色度適中、顏色鮮亮度好；良，切片中組織染色程度較好，存在少量背景；中，切片中組織染色程度一般，存在大量背景；差，切片中組織染色程度差甚至未染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 21.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。以率和百分比描述切片HE 染色結(jié)果的優(yōu)良率，采用χ2檢驗比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將A組的HE染色結(jié)果作為實驗參照，判斷B組的HE染色結(jié)果與A組的符合率。

2 結(jié)果

2.1 兩組切片HE 染色情況兩組切片均取材完整、厚度適宜、未見褶皺或刀痕、HE 染色核漿清晰、紅藍適度、透明潔凈、封裱美觀，具體可見圖1，2。

2.2 兩組切片HE 染色切片優(yōu)良率比較A 組與B組優(yōu)良率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組切片HE染色切片優(yōu)良率比較/例

2.3 B 組與A 組HE 染色結(jié)果符合率將A 組HE染色結(jié)果作為參照，B 組切片的優(yōu)、良、中、差染色結(jié)果與A 組染色結(jié)果的符合率分別為97.4%（456/468）、98.2%（459/468）、99.4%（465/468）、100%（468/468），符合率最小為97.4%，將A 組HE 染色結(jié)果作為參照，B組HE染色結(jié)果預(yù)期符合率較高。

3 討論

病理診斷是臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷的金標準，而優(yōu)質(zhì)的HE切片一直是病理診斷的重要依據(jù)［6］。HE染色法可以將各種組織或細胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點清晰分明地顯示出來，是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)以及科研中最基本和使用最廣泛的染色方法［7-8］。事實上，在近些年中，國內(nèi)外學(xué)者一直嘗試著使用各種環(huán)保試劑來替代甲醛和二甲苯在HE染色中的作用且成績斐然［9］。

聚羥基丙烯酸是由多個羥基丙烯酸聚合而成，性質(zhì)穩(wěn)定的環(huán)保固定液，其固定組織的主要作用機制可能是羥基和羧基基團發(fā)生可逆的酯化反應(yīng)，羧基和氨基集團中和反應(yīng)，前者生成穩(wěn)定的酯化物、硬化組織，后者維系穩(wěn)定的反應(yīng)條件，從而使聚羥基丙烯酸和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)［10］。Van-clear是一種從桔皮或其他植物中提取的、不含芳香族化合物，性質(zhì)穩(wěn)定［11］。本研究采用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear 代替?zhèn)鹘y(tǒng)試劑甲醛和二甲苯來處理切片，研究結(jié)果顯示，A、B兩組的切片處理優(yōu)良率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；將A組HE染色結(jié)果作為參照，則B 組HE 染色結(jié)果預(yù)期符合率較高。研究結(jié)果說明環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear處理切片與傳統(tǒng)試劑甲醛和二甲苯處理切片HE 染色效果相當，該結(jié)果與陳志強等［12］研究結(jié)果一致。

4%的中性甲醛水溶液一直是病理學(xué)界的權(quán)威固定溶液，通過與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生作用，其滲透性強，固定均勻，對組織收縮的影響較?。?3］。但有研究指出甲醛暴露可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)生理和病理功能的修改，干擾基因正常表達，且甲醛對環(huán)境具有污染性，可致癌和促癌［14］，在馬德里召開的第二次國際會議也肯定了甲醛的毒性影響［15］。而環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸同樣可以和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)，但其安全性高、無揮發(fā)性、固定的效率與甲醛相當，環(huán)保程度較甲醛高［16］。

100%的乙醇不能與石蠟相溶。進行HE 染色前需要脫去切片中的石蠟以利于染色劑更容易進入細胞和組織內(nèi)，該過程稱為脫蠟。透明脫蠟處理的作用機制主要是由于“相似相溶規(guī)律”，即溶質(zhì)溶劑的結(jié)構(gòu)相似而彼此相容［17］。常用的透明劑為二甲苯，二甲苯是由苯環(huán)組成的芳香烴化合物，而石蠟中80%～95%的成分為直鏈烷烴，相關(guān)資料指出［18-19］，Van-clear 主要由C8～C12 的飽和直鏈烷烴組合而成，與二甲苯的苯環(huán)結(jié)構(gòu)相比更相似于石蠟［11］，因此可以推測Van-clear 與石蠟更加互溶，脫蠟效果更好，更利于HE染料著色。

綜上所述，聚羥基丙烯酸和Van-clear 處理切片相較于甲醛和二甲苯更加環(huán)保、對病理工作人員的刺激性小、安全性高，在不改變?nèi)魏翁幚沓绦虻那闆r下效果相當，對于病理實驗室而言具有運用、推廣的意義。

（本文圖1，2見封三）

圖1 甲醛、二甲苯處理結(jié)果（HE×100）：1A為慢性宮頸炎組織；1B為宮頸腺癌組織；1C為脂肪組織；1D為骨髓組織圖2 聚羥基丙烯酸、Van-clear處理結(jié)果（HE×100）：2A為慢性宮頸炎組織；2B為宮頸腺癌組織；2C為脂肪組織；2D為骨髓組織