分泌型卷曲相關(guān)蛋白1通過MAPK/ERK信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲

雷建衛(wèi)，汪媛，賀利榮

結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大最常見的癌癥類型［1］。盡管其發(fā)病率一直在穩(wěn)步下降，其部分原因是診斷和治療方案的改善及社會風(fēng)險(xiǎn)因素暴露的減少，但結(jié)直腸癌的5 年預(yù)后生存率仍令人不甚滿意［2-3］。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）是一種Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路抑制劑，其在抗癌藥的開發(fā)中具有重要作用［4］。SFRP1 被認(rèn)為是一種WNT信號的抑制劑，其在許多腫瘤中表現(xiàn)出異常失調(diào)［5-7］。這說明SFRP1 的異常表達(dá)可能是WNT信號通路在腫瘤發(fā)生過程中被激活的重要機(jī)制。該基因在結(jié)直腸癌中雖已有研究報(bào)道，但其調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制尚未十分清楚。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的重要作用已得到許多研究的認(rèn)可，但是其與SFRP1 基因之間的關(guān)系尚未明白。本研究起止時(shí)間2018 年11 月至2019年6月。本研究旨在探索SFRP1與MAPK/ERK 信號通路在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiC、人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT8、SW480、RKO 購自ATCC；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Selleck 公司；LipofectamineTM2000 購自北京宜科思源公司；BCA 蛋白定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自碧云天公司；PVDF 膜購自德國羅氏診斷有限公司；RIPA 蛋白裂解液購自Invent 公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiC、人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT8、SW480、RKO 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3 的比例更換培養(yǎng)基，每2天傳代一次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將正常培養(yǎng)的HCT8 細(xì)胞隨機(jī)分成pcDNA 3.1 組（轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1）、pcDNA 3.1-SFRP1 組（轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1）、pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO 組（共 轉(zhuǎn) 染pcDNA 3.1-SFRP1 和DMSO）、pcDNA 3.1-SFRP1+IGF1 組（共轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1 和IGF1），按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染至HCT8 細(xì)胞。用qRTPCR法檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測細(xì)胞中SFRP1 的mRNA 表達(dá) 取適量細(xì)胞，用RNA 抽提試劑盒提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行SFRP1 檢測。以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算SFRP1 的表達(dá)。ΔΔCt=［（CTCTSFRP1-CTGAPDH）Treatmentgroup-（CTCTSFRP1-CTGAPDH）Controlgroup］。每個(gè)樣本做3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。引物信息（5'-3'）：SFRP1 正向引物TGACTTCAGGTCAAGGGATGGT，反向引物ACATCGCTTGAGGATCTGGAA；GAPDHF正向引物TGGGTGTGAACCATGAGAAGT，反向引物TGAGTCCTTCCACGATACCAA。

1.2.4 Western blotting 檢測細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 檢測SFRP1、波形蛋白（Vimentin）、纖維黏連蛋白（FN）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、MAPK/ERK信號通路關(guān)鍵基因（Ras）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的蛋白表達(dá)。

收集細(xì)胞，用裂解液充分裂解，提取總蛋白，進(jìn)行BCA 法定量，再用沸水浴變性處理10 min。取上清進(jìn)行上樣，蛋白電泳。電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白濕轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4 ℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4 ℃2 h。加發(fā)光液，曝光。用Quantity One 軟件處理?xiàng)l帶的灰度值，目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 Transwell 小室檢測細(xì)胞的遷移和侵襲 將Transwell 小室置于孔上，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱平衡30 min。然后將各組細(xì)胞消化，用純RPMI 1640培養(yǎng)基配制成5×105個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液。每個(gè)小室加入200 μL 細(xì)胞懸液，即每孔細(xì)胞約為1×105個(gè)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將24孔板放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，取出上腔，用棉簽擦去上室膜上未遷移的細(xì)胞，PBS 洗2 次，甲醇固定30 min。自然晾干后，用1 g/L 結(jié)晶紫染液染色20 min。棄染液，雙蒸水洗2 次。取出后于倒置顯微鏡下觀察拍照（400倍），計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野的總細(xì)胞數(shù)取平均值。

將轉(zhuǎn)染成功的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)。將基質(zhì)膠和RPMI 1640 培養(yǎng)基按1∶8 稀釋后（60 μL）鋪于培養(yǎng)小室上，風(fēng)干后備用，其他步驟同Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism 6.0 進(jìn)行相關(guān)圖片的繪制。計(jì)量資料用表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，用LSD-t法進(jìn)行兩組間的比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFRP1 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)與HCoEpiC相比，HCT8、SW480、RKO細(xì)胞中SFRP1 mRNA和SFRP1 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。其中HCT8對SFRP1 的變化差異最顯著，故選用該細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1、表1。

表1 SFRP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)/

表1 SFRP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)/

注：SFRP1 為分泌型卷曲相關(guān)蛋白1，HCoEpiC 為正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，HCT8、SW480、RKO均為人結(jié)直腸癌細(xì)胞。①與HCoEpiC比較，P＜0.05。

圖1 SFRP1蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)SFRP1 對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-SFRP1組細(xì)胞中SFRP1mRNA 表達(dá)顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 過表達(dá)SFRP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響/

表2 過表達(dá)SFRP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響/

注：pcDNA 3.1為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1，pcDNA 3.1-SFRP1為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1，SFRP1為分泌型卷曲相關(guān)蛋白1。

2.3 過表達(dá)SFRP1 對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與pcDNA 3.1 組相比，pcDNA3.1-SFRP1 組細(xì)胞中SFRP1 mRNA 表達(dá)顯著升高，Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的蛋白表達(dá)量均顯著降低，SFRP1、E-cadherin 的蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 過表達(dá)分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 過表達(dá)SFRP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/

表3 過表達(dá)SFRP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/

注：pcDNA 3.1 為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1，pcDNA 3.1-SFRP1 為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1，SFRP1 為分泌型卷曲相關(guān)蛋白1，Vimentin 為波形蛋白，F(xiàn)N為纖維黏連蛋白，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白，N-cadherin為N-鈣黏蛋白。

2.4 過表達(dá)SFRP1 抑制MAPK/ERK 信號通路的活性與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-SFRP1組細(xì)胞中Ras、mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、ERK 的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖4、表4。

表4 過表達(dá)SFRP1對MAPK/ERK信號通路活性的影響/

表4 過表達(dá)SFRP1對MAPK/ERK信號通路活性的影響/

注：pcDNA 3.1 為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1，pcDNA 3.1-SFRP1 為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1，SFRP1 為分泌型卷曲相關(guān)蛋白1，Ras 為絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號通路關(guān)鍵基因，mTOR 為雷帕霉素靶蛋白，ERK1/2 為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2，p-ERK1/2 為磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2，ERK為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶。

圖4 過表達(dá)分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）的HCT8細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.5 激活MAPK/ERK信號通路對SFRP1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響與pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO組相比，pcDNA3.1-SFRP1+IGF1組細(xì)胞中SFRP1 mRNA的表達(dá)顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高，Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的蛋白表達(dá)量均顯著升高，SFRP1、E-cadherin的蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見圖5、圖6、表5。

表5 激活絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號通路對SFRP1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響/

表5 激活絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號通路對SFRP1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響/

注：pcDNA 3.1-SFRP1為轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1，pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO 為共轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1和DMSO，pcDNA 3.1-SFRP1+IGF為共轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-SFRP1 和IGF，SFRP1 為分泌型卷曲相關(guān)蛋白1，Vimentin 為波形蛋白；FN 為纖維黏連蛋白，MMP-9 為基質(zhì)金屬蛋白酶9，Ecadherin為上皮鈣黏蛋白，N-cadherin為N-鈣黏蛋白。①與pc DNA 3.1-SFRP1+DMSO組比較，P＜0.05。

圖6 結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

SFRP1 位于8p12-11.1 號染色體，是WNT 信號通路的負(fù)調(diào)控因子之一，其被轉(zhuǎn)錄為35-kDa糖蛋白［8］。SFRP1 由兩個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域組成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域稱為netrin 和CRD，它們與卷曲受體有關(guān)［9］。SFRP1 由于沒有跨膜結(jié)構(gòu)域而被釋放到細(xì)胞外空間，可以通過與卷曲蛋白競爭性結(jié)合而阻斷WNT信號通路的激活［10］。Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin這些均為上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)化轉(zhuǎn)移的重要參與基因，與細(xì)胞的遷移和侵襲能力緊密相關(guān)，也與細(xì)胞中Wnt-βcatenin信號通路的活性相關(guān)［11-12］。

據(jù)報(bào)道，SFRP1的表達(dá)在多種人類癌癥類型中都下調(diào)［13］。吳瓊等［14］在結(jié)直腸癌的研究中報(bào)道，5-氮雜-2'-脫氧胞苷可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并上調(diào)SFRP1，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin 信號通路和上皮間質(zhì)化。由此推測，SFRP1的上調(diào)可能也可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究通過qRT-PCR、Western blotting 檢測了結(jié)直腸癌細(xì)胞中SFRP1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SFRP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中異常下調(diào)表達(dá)，這與前人關(guān)于SFRP1在各種腫瘤中的表達(dá)水平是相一致的；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SFRP1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并下調(diào)Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，這說明SFRP1可直接抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與下調(diào)Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin 的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)具有相關(guān)性；深入研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1 可抑制MAPK/ERK 信號通路的活性，推測SFRP1的功能除了與WNT信號通路的活性有關(guān)外，還可能與MAPK/ERK信號通路有關(guān)。

絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated proteinkinase，MAPK）信號通路由四個(gè)不同的級聯(lián)通路相聯(lián)系，包括細(xì)胞外信號相關(guān)激酶（ERK1/2）、Jun氨基末端激酶（JNK1/2/3）、p38-MAPK 和ERK5［15］。據(jù)報(bào)道，MAPK/ERK 通路與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡有關(guān)［16］。MAPK/ERK信號通路關(guān)鍵基因包括Ras、mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、ERK 等［17］。Han 等［18］在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MAPK/ERK信號通路在結(jié)直腸癌中可被原癌基因B淋巴細(xì)胞白血病前體蛋白轉(zhuǎn)錄因子3抗體（PBX3）異常激活，進(jìn)而有益于PBX3的促癌功能。Dahlmann等［19］報(bào)道，晚期糖基化終產(chǎn)物（RAGE）與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的預(yù)后生物標(biāo)志物S100A4相互作用，可直接導(dǎo)致過度活化的MAPK/ERK信號通路失活，進(jìn)而參與結(jié)直腸癌的遷移、侵襲調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)SFRP1可抑制MAPK/ERK信號通路的活性，深入研究發(fā)現(xiàn)，激活MAPK/ERK信號通路可逆轉(zhuǎn)SFRP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用，這說明該通路參與SFRP1在結(jié)直腸癌中的功能。

綜上所述，過表達(dá)SFRP1 可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制與抑制MAPK/ERK 信號通路的活性有關(guān)，為結(jié)直腸癌的治療提供參考。

（本文圖2，5見封三）

圖2 過表達(dá)SFRP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

圖5 激活MAPK/ERK信號通路對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲的影響