程序性死亡因子-1、程序性死亡配體-1、TNF家族B細(xì)胞活化因子-R在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)

拓進(jìn)寶，任羽，王麗萍

2延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)分院檢驗(yàn)科，陜西 延安716000

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）約占非霍奇金淋巴瘤的30%～35%，化療后易復(fù)發(fā)，是臨床難治性腫瘤之一［1-3］。程序性死亡因子-1（programmed death factor-1，PD-1）/程序性死亡配體-1（programmed death-ligand-1，PD-L1）信號通路在腫瘤免疫逃逸中扮演了重要角色，研究表明，通過抑制PD-1/PD-L1 信號通路，可以阻斷二者識別而重新恢復(fù)T 細(xì)胞的免疫功能，因此，阻斷PD-1/PD-L1 信號通路這種新思路有望對難治性DLBCL的治療帶來新進(jìn)展［4-5］。TNF 家族B 細(xì)胞活化因子（B cell-activating factor belonging to the TNF family，BAFF）在B 淋巴細(xì)胞的生長發(fā)育和分化凋亡過程中具有重要作用，其過度表達(dá)可破壞自身反應(yīng)性B 細(xì)胞產(chǎn)生及免疫耐受，刺激T細(xì)胞活化，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。BAFF 的受體BAFF-R 是BAFF 的調(diào)控因子，在DLBCL 免疫應(yīng)答中也扮演了重要角色，是病人臨床預(yù)后評估的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)［6］。目前，國內(nèi)對PD-1、PD-L1 及BAFF-R 在DLBCL 組織中的差異性表達(dá)及潛在免疫治療價(jià)值的研究較少。為此，本研究對28 例DLBCL 組織及瘤旁組織樣本進(jìn)行了免疫組化檢測，探討了PD-1、PD-L1及BAFF-R 在DLBCL 治療中的臨床意義，詳細(xì)結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以延安大學(xué)附屬醫(yī)院血液科2019年1 月至2020 年4 月初診的28 例DLBCL 組織及瘤旁組織樣本作為研究對象，所有組織樣本以石蠟包埋待檢。男19 例，女9 例；年齡范圍51～81 歲，年齡（68.35±12.57）歲。腫瘤Ann Arbor/Costwards 分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期4 例。病理分型：ABC 亞型16 例，GCB 亞型12 例。EBV DNA 的PCR 檢測：陽性10 例，陰性18 例。國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評分：0 分4 例，1分5 例，2 分8 例，3 分5 例，4 分4 例，5 分2 例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤者；（2）術(shù)前接受放化療者。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 免疫組化檢測方法組織樣本PD-1、PD-L1 及BAFF-R 檢測采用EnVison 兩步染色法，一抗鼠抗人PD-1 單克隆抗體（MX033）及兔抗人PD-L1 單克隆抗體（MXR003）購自福州邁新公司，二抗PD-1 及PD-L1 為即用型，購自北京中杉金橋公司，BAFF-R抗體購自Proteintech 公司。將組織樣本切成4 μm厚切片，置于烤片機(jī)中烘烤2～3 h，冷卻；常規(guī)脫蠟后加檸檬酸鹽，置高壓鍋中行抗原修復(fù)，然后用緩沖液沖洗后加二抗，置37 ℃孵育箱中孵育25 min，再以緩沖液沖洗后滴加DAB 顯色劑；室溫顯色滿意后以雙蒸水沖洗洗掉切片上的DAB；滴加蘇木精復(fù)染，染色滿意后以雙蒸水沖洗洗掉切片上的蘇木精并放入堿性溶液返藍(lán)；將切片依次放入蒸餾水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ（各2 min）以及二甲苯Ⅱ（10 min）和二甲苯Ⅰ（10 min）脫水，最后中性樹脂封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果采用染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)評分乘積進(jìn)行判定［7］，染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為陰性0 分、弱陽性1 分、中度陽性2 分、強(qiáng)陽性3分；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)為無陽性細(xì)胞0分、陽性細(xì)胞占比1%～10%為1 分、陽性細(xì)胞占比11%～50%為2 分，陽性細(xì)胞占比≥51%為3 分。兩項(xiàng)評分之積即為PD-1、PD-L1 及BAFF-R 的免疫組化評分，≤4 分為低表達(dá)，5～9 分為高表達(dá)。陽性率=免疫組化陽性數(shù)÷總例數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用或例（%）表示，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL組織及瘤旁組織PD-1、PD-L1 及BAFF-R表達(dá)DLBCL 組織PD-1、PD-L1及BAFF-R陽性表達(dá)積分均顯著高于瘤旁組織，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 淋巴瘤組織及瘤旁組織PD-1、PD-L1及BAFF-R表達(dá)水平對比/（分，）

表1 淋巴瘤組織及瘤旁組織PD-1、PD-L1及BAFF-R表達(dá)水平對比/（分，）

注：PD-1 為程序性死亡因子-1，PD-L1 為程序性死亡配體-1，BAFF-R為TNF家族B細(xì)胞活化因子-R。

2.2 淋巴瘤組織PD-1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系淋巴瘤組織PD-1 表達(dá)與臨床病理特征無相關(guān)性（P＞0.05），具體見表2。

表2 淋巴瘤組織PD-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 淋巴瘤組織PD-L1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系不同Ann Arbor/Costwards 分期、病理分型及EBV檢測結(jié)果間的淋巴瘤組織PD-L1表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 淋巴瘤組織BAFF-R表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 淋巴瘤組織BAFF-R 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系不同Ann Arbor/Costwards分期、病理分型、IPI評分及EBV 檢測結(jié)果的淋巴瘤組織BAFF-R 表達(dá)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 淋巴瘤組織BAFF-R表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

隨著腫瘤免疫學(xué)的不斷發(fā)展，細(xì)胞免疫在腫瘤治療中的重要作用已為學(xué)界所重視。PD-1/PD-L1信號通路的激活則阻斷了活化T 細(xì)胞的這一重要功能，其不僅抑制T 細(xì)胞的正常功能而無法進(jìn)行抗腫瘤免疫應(yīng)答，而且還通過抑制T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答信號通路而激活腫瘤浸潤T 細(xì)胞的活性［8］。研究證實(shí)［9-10］，PD-1 和PD-L1 在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中扮演了重要角色，目前已成為臨床重要的免疫檢查點(diǎn)之一。在正常情況下，T 細(xì)胞被激活后，PD-1 會在活化T 細(xì)胞表明迅速表達(dá)，與PD-L1 結(jié)合并磷酸化PD-1 胞內(nèi)免疫受體的酪氨酸抑制及轉(zhuǎn)換基序，去磷酸化SHP-1/2 的下游信號分子，導(dǎo)致SHP-1 和SHP-2 募集而抑制PI3K 活性，減少TNF-α、IL-2 及IFN-γ 等細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而起到抑制T 細(xì)胞增殖、維持免疫平衡的作用［11］。PD-1 的配體有PD-L1 和PD-L2 兩個(gè)，二者相似性高，但PD-L2 分布較為局限，僅在樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少量B細(xì)胞表明有表達(dá)。PD-L1 作為B7 受體家族成員之一PD-1 的配體，主要在T 細(xì)胞等抗體遞呈細(xì)胞中表達(dá)，在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)，其與PD-1 結(jié)合，共同誘導(dǎo)了PD-1 陽性腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞的凋亡，是免疫應(yīng)答過程調(diào)節(jié)的關(guān)鍵點(diǎn)［12］。PD-1/PD-L1 信號通路激活導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的機(jī)制有四：一是干擾T 細(xì)胞正常功能而誘導(dǎo)其凋亡，增加腫瘤免疫耐受；二是抑制T 細(xì)胞增殖；三是抑制細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞活性；四是抑制IL-2 和IFNγ 等細(xì)胞因子產(chǎn)生而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。Suzuki等［13］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織PD-L1 高表達(dá)能夠協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避化療所致的細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)化療藥物耐藥。彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤PD-L1 高表達(dá)能夠明顯促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)淋巴瘤細(xì)胞的侵襲能力。本研究結(jié)果中，DLBCL 組織PD-1 及PD-L1陽性表達(dá)積分均顯著高于瘤旁組織，且淋巴瘤組織PD-L1 表達(dá)與Ann Arbor/Costwards 分期、病理分型及EBV 感染存在密切關(guān)系，但淋巴瘤組織PD-1 表達(dá)則與臨床病理特征無關(guān)。這與Kwon 等［14］和Kataoka 等［15］的研究結(jié)論基本一致。綜上所述，PD-1/PD-L1 高表達(dá)所致的腫瘤免疫逃逸與活化T 細(xì)胞功能受抑制有關(guān)，故金靜霞等［16］認(rèn)為，PD-1/PD-L1免疫抑制劑可顯著提高抗DLBCL 活性。2016 年，美國FDA 批準(zhǔn)了Nivolumab PD-1 抗體用于治療難治性霍奇金淋巴瘤，為淋巴瘤的免疫療法開啟了新篇章［17-18］。

BAFF是TNF家族的重要成員，對調(diào)節(jié)B細(xì)胞生長發(fā)育及抗體類型轉(zhuǎn)換、T 細(xì)胞活化等具有重要作用。BAFF 高表達(dá)與自身反應(yīng)性B 細(xì)胞產(chǎn)生受抑制和自身免疫耐受被破壞有關(guān)。BAFF 信號高表達(dá)對人體體液免疫應(yīng)答有重要影響，是引發(fā)腫瘤的重要因素。因此，阻斷或改變BAFF 信號通路有望成為治療DLBCL的新方法。本研究結(jié)果顯示，DLBCL組織BAFF-R 陽性表達(dá)積分顯著高于瘤旁組織，淋巴瘤組織中BAFF-R表達(dá)與Ann Arbor/Costwards 分期、病理分型、IPI 評分及EBV 感染密切相關(guān)。曾輝等［19］研究證實(shí)，BAFF-R 是DLBCL 預(yù)后及靶向治療的重要判斷指標(biāo)，也是DLBCL 經(jīng)R-CHOP 化療后病人預(yù)后的獨(dú)立影響因素。從研究結(jié)果來看，PD-1/PD-L1 與BAFF-R 在DLBCL 組織中的高表達(dá)存在極高的一致性，且在臨床病理特征方面PD-L1 與BAFF-R 表達(dá)也存在較好的協(xié)調(diào)性，故而，二者不僅是DLBCL 重要的治療靶點(diǎn)，也是價(jià)值較高的預(yù)后評價(jià)指標(biāo)。

綜上，程序性死亡配體-1 及TNF 家族B 細(xì)胞活化因子-R 在DLBCL 組織中呈高表達(dá)，且與DLBCL分期、病理分型及EBV 感染密切相關(guān)，二者聯(lián)合檢測對病人預(yù)后評估可能具有較高價(jià)值；對難治性DLBCL 而言，以程序性死亡配體-1 及TNF 家族B 細(xì)胞活化因子-R 的信號通路為靶點(diǎn)，是潛在的免疫治療方案。故而，DLBCL 的免疫治療是今后臨床免疫學(xué)研究的新方向。